CEPAVE   05420
CENTRO DE ESTUDIOS PARASITOLOGICOS Y DE VECTORES
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Expresión de la proteína p24 del Virus de la Leucosis Bovina en el sistema de baculovirus para su aplicación al diagnóstico de la enfermedad
Autor/es:
LARSEN A; MORTOLA EC; SERENA MS; METZ GE; PANEI CJ; ECHEVERRIA MG; GONZALEZ ET
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011
Resumen:
El virus de la leucosis bovina (VLB) es un retrovirus responsable de la leucosis enzoótica bovina (LEB), enfermedad de distribución mundial presente en nuestro pais. La enfermedad puede presentarse en forma asintomática, con linfocitosis persistente y en menor proporción inducir tumores linfoideos. El impacto económico de esta enfermedad radica en las pérdidas por decomisos en frigorífico, disminución en la productividad y la perdida de mercados de exportación de semen y embriones. El VLB, como otros retrovirus, contiene genes que codifican proteínas de importancia diagnóstica como la glicoproteína de superficie gp51 y la proteína mayoritaria de la cápside p24, ambas responsables de inducir una fuerte y persistente respuesta inmune humoral. En la actualidad, las pruebas serodiagnósticas se basan en la detección de anticuerpos contra gp51. La descripción de la aparición temprana de la respuesta humoral contra la proteína p24 y el éxito de su utilización como antígeno diagnóstico obtenido por diferentes sistemas de expresión motiva el presente trabajo. El objetivo fue la expresión de la proteína recombinante p24 en células de insecto, por clonado del gen que codifica para dicha proteína en baculovirus. Este sistema ofrece varias ventajas frente a su producción por métodos convencionales como en sistemas bacterianos y abre un camino promisorio para el desarrollo de pruebas diagnósticas, no solo de alto rendimiento y bajo costo, sino también de alta sensibilidad evitando resultados falsos. Se utilizó un sistema comercial de baculovirus, BaculoDirect™ GST Gateway®. El ADN del gen que codifica para la proteína p24 se obtuvo mediante la técnica de PCR, a partir del ADN genómico de células FLK crónicamente infectadas con VLB. Se utilizaron primers diseñados de acuerdo a la secuencia de referencia (Sagata N., 1985), pero incluyendo en el primer forward la secuencia CACC para el clonado direccionado en el vector de transferencia pENTRTM /D TOPO®. Una vez realizada la reacción de recombinación in vitro que permite la transferencia directa del gen de la proteína p24 del vector de transferencia pENTRTM /D TOPO® -p24 recombinante al ADN linearizado del baculovirus, se infectaron células de insecto Sf9 y se obtuvo el stock viral P1 del cual se aislaron baculovirus recombinantes por ensayo en placa. Para comprobar la expresión de la proteína, se realizó la técnica de SDS-PAGE con células Sf9 infectadas con los clones de baculovirus recombinantes aislados por ensayo de placa. La tinción con azul brillante de Coomasie reveló la presencia de una banda correspondiente al peso molecular de la proteína p24. Se prosiguió con la técnica de Western blot, con la cual se comprobó la autenticidad antigénica de la proteína recombinante p24 frente a un suero control positivo internacional. La producción de la proteína p24 en el sistema de expresión de BaculoDirect™ GST Gateway®, permitió producir proteína recombinante que mantuvo la capacidad antigénica de ser reconocida específicamente por anticuerpos de un suero control positivo internacional y no reaccionar inespecíficamente frente a un suero control negativo. La aplicación del sistema de expresión en baculovirus arroja resultados muy prometedores en la producción de la proteína p24 recombinante para su potencial uso como antígeno en pruebas serológicas para el inmunodiagnóstico de la infección por el VLB. Este trabajo constituye el tema de tesis de la maestría de Microbiología Molecular USAM INEI ANLIS Dr. Carlos Malbran.