Efecto del silenciamiento del ARNm de INGAP (Proteína Asociada a la Neogénesis Insular) sobre la secreción de insulina in vitro.

FLORES LUIS EMILIO; DEL ZOTTO HÉCTOR; RASCHIA MARÍA AGUSTINA; MADRID VIVIANA; GAGLIARDINO JUAN JOSÉ

Buenos Aires

Congreso; XVI Congreso Argentino de Diabete; 2008

Sociedad Argentina de Diabetes (SAD)

Introducción: El INGAP es un factor de crecimiento producido por células pancreáticas (acinares, ductales y células insulares no beta). Promueve la neogénesis insular, puede revertir un 50% la diabetes inducida por estreptozotocina en hámsteres y aumenta la secreción de insulina en respuesta a diferentes estímulos. Objetivos: Estudiar in vitro el efecto de la disminución de la producción de INGAP por células insulares sobre la secreción de insulina. Métodos: Se aislaron islotes pancreáticos de hámsteres normales y se cultivaron por 4 días con o sin 10 ug/ml de INGAP-PP (pentadecapéptido derivado del INGAP que reproduce los efectos de la proteína entera). Posteriormente los islotes se dividieron en tres grupos: a) transfectados con liposomas que contienen un siRNA específico de INGAP, b) transfectados con un siRNA no inhibitorio marcado con GFP (Green Fluorescent Protein) y c) transfectados con liposomas vacíos (grupo control). La eficiencia de la transfección se determinó por microscopía de fluorescencia. Para determinar el grado de inhibición producido por el siRNA sobre el ARNm de INGAP, se aisló ARN total de los islotes de los tres grupos, se los retro-transcribió y posteriormente se cuantificó (PCR cuantitativa en tiempo real) utilizando primers específicos para el ADNc de INGAP. El efecto del siRNA de INGAP sobre la secreción de insulina se evaluó incubando islotes con glucosa 3.3 (G3.3) ó 16.7 (G16.7) mM; la insulina liberada al medio se cuantificó por RIA. Resultados: El análisis de eficiencia de la transfección de islotes enteros mostró que sólo las células insulares periféricas incorporaron la fluorescencia verde, por lo que esta metodología resulta útil para silenciar el ARNm de genes que, como el de INGAP, se expresan en esa porción del islote. El siRNA incorporado a los islotes produjo una disminución del 35 al 50% del ARNm de INGAP. Respecto a la secreción de insulina, todos los grupos liberaron insulina en función de la concentración de glucosa: G3.3 vs. G16.7, control: 1.85±0.18 vs. 4.15±0.35, INGAP-PP: 2.45±0.07 vs. 5.33±0.55, siRNA: 1.66±0.38 vs. 2.30±0.50 mg/dl, (p<0.05 en todos los casos). El siRNA de INGAP disminuyó significativamente la secreción de insulina tanto con G3.3 (10%) como con G16.7 (44%), respecto de la obtenida en islotes control (p<0.05 para ambos casos). Esta disminución fue del 32 y 57 % respectivamente cuando se la comparó con la registrada en islotes cultivados previamente en presencia de INGAP-PP (p<0.05 para G3.3 y G16.7). Conclusiones: Nuestros resultados confirman el efecto potenciador del INGAP-PP sobre la secreción de insulina en respuesta a la glucosa y demuestran que el INGAP tendría un efecto tónico fisiológico sobre dicha secreción. Estos resultados alientan la expectativa respecto a la posible utilización del INGAP-PP para optimizar la función secretora de islotes preservados para futuros transplantes como así también para el tratamiento de personas con diabetes.