Purificación mediante FACS de una población celular CK19+ originada a partir de células madre embrionarias murinas y su diferenciación hacia células productoras de insulina

FRANCINI F; NAUJOK O; JÖRNS A; LENZEN S

Buenos Aires

Congreso; XVI Congreso Argentino de Diabetes; 2008

Sociedad Argentina de Diabetes

Introducción: La escasés de donantes de islotes de Langerhans para la terapia de reeplazo en la DMT1 ha llevado al desarrollo de estrategias de obtención de células con características similares a las de células B pancreáticas. Las células madre embrionarias (CME), que tienen la potencialidad de diferenciarse hacia multiples tipos celulares, representan una fuente potencial para la obtención de células productoras de insulina con fines terapéuticos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo de diferenciación que conduzca CME hacia células productoras de insulina, conjuntamente con una técnica de purificación de las mismas. Materiales y Métodos: Se clonó un fragmento de 2.9 kb del promotor del gen Krt19 (citoqueratina 19 – CK19) y se puso bajo su control la expresión de la proteina fluorescente amarilla (eYFP). La contrucción pCK19-eYFP se transfectó en CME ES-D3. Estas se mantuvieron en medio de diferenciación. A los 12, 19 y 26 días de cultivo las células eYFP+ y eYFP- se separaron mediante FACS. Se evaluó la expresión génica en dichas poblaciones celulares mediante qPCR. A los 26 días de diferenciación se evaluó el contenido y la secreción de insulina en respuesta a la glucosa. Se realizaron estudios mediante microscopía electrónica (ME) e inmunohistoquímica. Resultados: La expresión génica de CK19 se incrementó 4-7 veces en células eYFP+ respecto a células eYFP-. La anhidrasa carbónica 2 (otro marcador de células de origen ductal), aumentó 2 veces en células eYFP+ al día 12 y 9 veces al día 26 respecto a los valores encontrados en células eYFP-. La expresión génica de insulina fue baja en ambas poblaciones (eYFP+ y eYFP-) hasta el día 19. Sin embargo se incrementó 80 veces en células eYFP+ al día 26. Esta expresión fue 38 veces mayor que en eYFP-. No se detectó expresión génica de glucagon ni a los 12 ni 19 días. Sin embargo, mientras que dicha expresión permaneció no detectable al día 26 en células eYFP+, se incrementó 12 veces en células eYFP-. Al día 26, las células eYFP+, en contraste con las eYFP-, mostraron signos de diferenciación en organelas involucradas en la síntesis, procesamiento, almacenaje y liberación de insulina. Adicionamente, estas células eYFP+ mostraron inmunopositividad para peptido C e insulina. Las células CK19- no mostraron positividad para péptido-C. Las células eYFP+, que también lo fueron para CK19, mostraron un contenido de insulina 50 veces mayor que las CK19- y una secreción de insulina en respuesta a 30 mM de glucosa significativamente mayor. Conclusiones: Los resultados obtenidos muestran que el procedimiento empleado, que combina un protocolo de difereciación de CME con una estrategia de separación mediante FACS, es útil para la obtención de células que expresan el gen de insulina y que procesan, almacenan y secretan dicha hormona en respuesta a la glucosa. Estas células son asimismo positivas para CK19 lo que refuerza el concepto del origen ductal de las células productoras de insulina.: La escasés de donantes de islotes de Langerhans para la terapia de reeplazo en la DMT1 ha llevado al desarrollo de estrategias de obtención de células con características similares a las de células B pancreáticas. Las células madre embrionarias (CME), que tienen la potencialidad de diferenciarse hacia multiples tipos celulares, representan una fuente potencial para la obtención de células productoras de insulina con fines terapéuticos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo de diferenciación que conduzca CME hacia células productoras de insulina, conjuntamente con una técnica de purificación de las mismas. Materiales y Métodos: Se clonó un fragmento de 2.9 kb del promotor del gen Krt19 (citoqueratina 19 – CK19) y se puso bajo su control la expresión de la proteina fluorescente amarilla (eYFP). La contrucción pCK19-eYFP se transfectó en CME ES-D3. Estas se mantuvieron en medio de diferenciación. A los 12, 19 y 26 días de cultivo las células eYFP+ y eYFP- se separaron mediante FACS. Se evaluó la expresión génica en dichas poblaciones celulares mediante qPCR. A los 26 días de diferenciación se evaluó el contenido y la secreción de insulina en respuesta a la glucosa. Se realizaron estudios mediante microscopía electrónica (ME) e inmunohistoquímica. Resultados: La expresión génica de CK19 se incrementó 4-7 veces en células eYFP+ respecto a células eYFP-. La anhidrasa carbónica 2 (otro marcador de células de origen ductal), aumentó 2 veces en células eYFP+ al día 12 y 9 veces al día 26 respecto a los valores encontrados en células eYFP-. La expresión génica de insulina fue baja en ambas poblaciones (eYFP+ y eYFP-) hasta el día 19. Sin embargo se incrementó 80 veces en células eYFP+ al día 26. Esta expresión fue 38 veces mayor que en eYFP-. No se detectó expresión génica de glucagon ni a los 12 ni 19 días. Sin embargo, mientras que dicha expresión permaneció no detectable al día 26 en células eYFP+, se incrementó 12 veces en células eYFP-. Al día 26, las células eYFP+, en contraste con las eYFP-, mostraron signos de diferenciación en organelas involucradas en la síntesis, procesamiento, almacenaje y liberación de insulina. Adicionamente, estas células eYFP+ mostraron inmunopositividad para peptido C e insulina. Las células CK19- no mostraron positividad para péptido-C. Las células eYFP+, que también lo fueron para CK19, mostraron un contenido de insulina 50 veces mayor que las CK19- y una secreción de insulina en respuesta a 30 mM de glucosa significativamente mayor. Conclusiones: Los resultados obtenidos muestran que el procedimiento empleado, que combina un protocolo de difereciación de CME con una estrategia de separación mediante FACS, es útil para la obtención de células que expresan el gen de insulina y que procesan, almacenan y secretan dicha hormona en respuesta a la glucosa. Estas células son asimismo positivas para CK19 lo que refuerza el concepto del origen ductal de las células productoras de insulina.