Selección asistida de genes que otorgan tolerancia a áfidos

TOCHO ÉRICA

Bahía Blanca

Congreso; 4to Congreso Latinoamericano de Cebada; 2013

INTA Estación Experimental Agropecuaria Bordenabe

Dada la importancia del cultivo de cebada, a nivel mundial ocupando el cuarto lugar después del trigo, el maíz y el arroz, y también a nivel nacional con una aumento en la superficie sembrada y una consecuente suba de la producción en Tn de grano cosechado, es importante hacer foco en diversos aspectos que hacen a este cultivo. El aumento en los rendimientos de las últimas campañas también se debe a la incorporación de nuevas variedades mejoradas, por ello es importante continuar con la mejora de las líneas existentes y generar nuevas líneas superiores no sólo en producción sino también en resistencia genética a plagas. Desde la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, que depende de la Universidad Nacional de La Plata, se viene trabajando profusamente desde hace más de 5 años, en la caracterización de una población experimental de cebada con el propósito de distinguir materiales tolerantes a Schizaphis graminum y a Diuraphis noxia, e identificar genes de tolerancia a éstos áfidos para su localización cromosómica. La búsqueda de estos genes se realiza con el fin de obtener recursos genéticos de fácil aprovechamiento en los planes de  mejora de  cebada como una estrategia de control más efectiva y ambientalmente sustentable dentro de un Manejo Integrado de Plagas (MIP), haciendo uso de las defensas desarrolladas por los hospedantes para combatir a sus agresores. Los áfidos pertenecen a un grupo de insectos suctores que se alimentan principalmente en el floema de las plantas mediante la utilización de los estiletes(1). Los daños que los áfidos provocan a sus huéspedes pueden ser de tipo directo debido a su alimentación, produciendo pérdida de nutrientes y fotosintatos y de tipo indirectos que están relacionados a su capacidad de ser vectores de virus, o al desarrollo de ciertas micosis asociadas a los azúcares que excretan, junto con las deyecciones, reduciendo la biomasa fotosintetizante(2). Los áfidos son considerados plagas de complejo control y por ello es de gran importancia la necesidad de identificar formas de resistencia que otorguen una mayor durabilidad y sustentabilidad a su control. El pulgón verde de los cereales, Schizaphis graminum (Rondani) y el pulgón ruso del trigo, Diuraphis noxia (Kurdjumov), son dos plagas muy importantes que afectan los cultivos de cereales, entre ellos a la cebada cervecera (Hordeum vulgare L.). El pulgón verde de los cereales (PVC) fue originariamente descripto en Italia(3), estando en la actualidad ampliamente distribuido en Asia, África, Australia y América, siendo una plaga de gran importancia económica. Los daños que provoca en las zonas de infestación de las plantas son necrosis y clorosis debido al colapso celular causado por una alteración en la permeabilidad de las membranas celulares del núcleo, mitocondrias y cloroplastos del vegetal(4). Esta especie provoca la reducción del volumen radical y del crecimiento aéreo en distintos cereales(5). Se han identificado varios genes de resistencia a este áfido en trigo (al menos 10) y otros  2 genes en cebada.  El pulgón ruso del trigo (PRT) es una especie originaria de Asia Central y Europa Oriental (6). Se alimenta de la base de las hojas jóvenes de las plantas y el daño principal se debe a una fitotoxina inyectada por el áfido durante la alimentación que provoca ruptura de cloroplastos y membranas celulares en plantas susceptibles. Como consecuencia de la alimentación, se producen estrías longitudinales de color blanco o amarillo en las hojas y el enrollamiento de las mismas alrededor de la nervadura central, formando un refugio tubular para los áfidos que impide el acceso de los predadores, parásitos e insecticidas de contacto. Si la alimentación ocurre en la hoja bandera, las aristas de las espigas pueden quedar atrapadas provocando la distorsión y deformación de la misma ocasionando mermas importantes en el rendimiento (7). Se identificaron al menos 11 genes de resistencia en trigo (Dn), tres QTLs en cebada cervecera y otros genes de resistencia en cebada silvestre. En la Argentina los ataques de estas plagas son ocasionales, pero ha habido años cuya presencia ha provocado daños y pérdidas intensas de rendimiento en el cultivo de trigo y de cebada. El material de estudio consistió en una población de mapeo de 94 líneas recombinantes doble haploides (LRD) (de las cuales se evaluaron 85) de cebada cervecera (Oregon Wolf Barley), provenientes del cruzamiento entre los progenitores Dominante (Dom) y Recombinante (Rec). Estas LRD son mantenidas y provista por el Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) de Alemania, en donde también se mapearon marcadores contrastantes entre ambos padres. Las líneas parentales, así como también las LRD presentan diferencias altamente contrastantes en numerosas características tales como el ciclo, el porte, presencia o ausencia de aristas y pelos, variación en el color de las glumas y de aleuronas, sólo por nombrar algunas de ellas. Esta población es ampliamente utilizada para el mapeo de caracteres de interés en distintos programas de mejoramiento debido al alto grado de saturación del mapa genético con marcadores RFLP, AFLPs, ESTs, SNPs. Esta población fue caracterizada fenotípicamente según los diferentes mecanismos de resistencia de las plantas a insectos definidos por Painter (8) como antixenosis, tolerancia y antibiosis. La antixenosis, expresa la capacidad de la planta de no compatibilizar con el parásito, evitando que actúe como hospedera, no dejando que el insecto la utilice para oviposición, alimento o refugio. Se evaluó mediante el ensayo de no preferencia siguiendo el método de libre elección del hospedero que consiste en distribuir en forma de círculo una planta de cada LRD y ambos padres con la segunda hoja dirigida hacia el centro del mismo. Se colocó en el medio una cantidad de áfidos equivalente a 10 pulgones adultos por planta, permitiendo la libre elección de los hospederos. El ensayo fue llevado a cabo en oscuridad para evitar que la luz actuara como estímulo de elección por parte de los áfidos y la distribución de los genotipos fue totalmente al azar. A las 24 horas se registró el número de áfidos presente en cada planta, identificando luego de varias repeticiones a las líneas más y menos antixenóticas. La tolerancia representa la capacidad de la planta de superar el ataque de una plaga, de manera que no haya disminución significativa de la calidad y cantidad de su producción. Se realizaron ensayos con plántulas de cebada que fueron infestadas en el estado de 2da hoja expandida con 10 pulgones por planta de PVC o PRT, según el tratamiento y plantas testigo sin infestación.  La tolerancia de las líneas evaluadas fue determinada según la medición del área foliar, del peso fresco y seco y del contenido de clorofila de las plántulas de cebada. En tanto, la antibiosis está determinada por aquellos efectos preventivos de daño o destructivos que el hospedero ejerce principalmente sobre el crecimiento, desarrollo o sobrevivencia del insecto. Para su evaluación se realizaron ensayos individuales en los que se realizó el seguimiento del ciclo de vida de los pulgones desde su nacimiento hasta la muerte, sobre plantas individuales de las LRD y ambos padres, las cuales fueron infestadas con PVC o PRT según el tratamiento.  Las observaciones se realizaron cada 48 horas, removiendo la descendencia luego de ser contada en cada medición hasta la finalización del período reproductivo de la hembra adulta. Se midieron y calcularon parámetros reproductivos y de crecimiento del áfido, tales como la fecundidad, la longevidad, longitud del ciclo de vida inmadura, período reproductivo, tasa intrínseca de incremento poblacional (rm), entre otras. Ambos padres y las LRD respondieron de manera diferente a la presencia de uno u otro áfido en la evaluación de los distintos mecanismos de resistencia. El padre Rec y la mitad de las LRD resultaron antixenóticas al PRT, en tanto en presencia de PVC ningún padre mostró diferencias en su nivel de antixenosis. Ante la infestación del PVC y al PRT, Rec fue tolerante, en cambio Dom no lo fue. Es importante destacar que dentro de las LRD hubo diferentes grados de tolerancia, muchas de ellas respondieron como uno u otro padre. Otras mostraron valores intermedios con un comportamiento aditivo y algunas superaron al progenitor más tolerante mostrando un crecimiento compensatorio, exhibiendo herencia transgresiva. Además, los análisis de medias mostraron diferencias significativas entre los progenitores Dom y Rec en todos los parámetros de antibiosis evaluados, Las líneas recombinantes condicionaron diferentes grados de antibiosis al PVC. En todos los parámetros se observó herencia transgresiva. Subsecuentemente a la caracterización fenotípica se realizó la caracterización molecular para establecer la existencia de asociación entre los mecanismo de resistencia (antixenótica, tolerancia y antibiosis) y los marcadores moleculares mapeados en los cromosomas de las LRD provenientes de esta población segregante de mapeo, con el propósito de localizar loci de efectos cuantitativos (QTLs) de resistencia. Las características genéticas de las plantas pueden modificarse por métodos de selección tradicional o asistida por marcadores moleculares (MAS, del inglés Marker assisted selection). La MAS es una herramienta muy efectiva para acelerar la producción de cultivares con caracteres deseados en general, y en particular con resistencia a insectos que tiene como principal ventaja acortar los plazos para incorporar nuevos genes en materiales comerciales incrementando sus niveles de defensas contra insectos(9). Solo el mecanismo de tolerancia asoció a marcadores moleculares. Se identificaron dos QTLs principales en los cromosomas 1H y 2H que explicaron el 79% y el 90% de la variación fenotípica de la tolerancia a PRT respectivamente. El contenido de clorofila asoció a marcadores del cromosoma 1H (WMC1E8, MWG912, ABC261, MWG2028 y Blp), en tanto el área foliar estuvo asociada a marcadores moleculares del cromosoma 2H (BmAc0125, Vrs1, BmAc0144f y BmAg0113e)(10). Por otro lado, la tolerancia a PVC estuvo asociada a tres QTLs. De igual modo que con la tolerancia a PRT, el área foliar asoció con los mismos marcadores del cromosoma 2H, explicando en este caso el 82% de la variación fenotípica. Los otros dos QTLs mapearon en el cromosoma 5H y 7H(11). La tolerancia al PVC y al PRT, en esta población de cebada, está dada por múltiples genes y no por un gen mayor. Las LRD portadoras de un buen nivel de tolerancia a uno u otro áfido podrían usarse como fuente de resistencia en cebadas comerciales. La identificación de marcadores moleculares ligados a genes de defensa, o a QTL permite la utilización de técnicas de selección que aceleran los procesos de mejoramiento de la resistencia a los áfidos en cebada. Los genes identificados podrían contribuir al desarrollo de programas eficientes de mejoramiento genético para resistencias de baja presión selectiva a Schizaphis graminum y a Diuraphis noxia que aportan una resistencia durable que puede incluirse en cebada.