Diseño y optimización en la formulación de nanopartículas de benznidazol por un método de nanoprecipitación. Estudios in-vitro/in-vivo en modelo murino.

CLAUDIO JAVIER SALOMON; MARCELA S. RIAL; LAURA E. FICHERA; MARIA L. SCALISE; MÓNICA I. ESTEVA; EVA CAROLINA ARRUA

Buenos Aires

Encuentro; Nanomercosur 2017; 2017

Diseño y optimización en la formulación de nanopartículas de benznidazol por un método de nanoprecipitación. Estudios in-vitro/in-vivo en modelo murino.Eva C. Arrúa2, María L. Scalise1, Marcela S. Rial1, Mónica I. Esteva1, Laura E. Fichera1 y Claudio J. Salomon2.1Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chaben, ANLIS CG Malbrán, Ministerio de Salud, Buenos Aires, Argentina2Instituto de Química Rosario, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (IQUIR-CONICET), Rosario, Argentina; Área Técnica Farmacéutica, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina.1. IntroducciónEl Chagas o tripanosomiasis americana es la parasitosis de mayor incidencia en los países menos desarrollados, y se encuentra en el grupo de enfermedades desatendidas. Esta parasitosis es causada por el protozoo intracelular Trypanosoma cruzi, y afecta a cerca de 10 millones de personas en América Latina y sur de Estados Unidos de Norteamérica1. A pesar de su alta incidencia, hasta la fecha sólo hay dos fármacos aprobados para su tratamiento: Benznidazol (BNZ) y Nifurtimox. El BNZ es el fármaco de elección en varios países y se recomienda tanto para las fases agudas y crónicas recientes, así como, para infecciones congénitas2. A pesar de ser prescripto tanto en adultos como en niños, BNZ es poco soluble en agua y esto tiene un impacto directo en su absorción y posterior biodisponibilidad. Como consecuencia, la búsqueda de nuevos sistemas de administración de BNZ que podrían ser eficaces para la enfermedad de Chagas sigue siendo la principal prioridad para controlar esta infección desatendida.La nanotecnología es una herramienta conveniente para mejorar la solubilidad acuosa y la biodisponibilidad adicional de fármacos hidrófobos. A pesar de que la nanotecnología es ampliamente aplicada para desarrollar nanomedicinas para varias patologías, incluyendo cáncer, trastornos cardiovasculares y neurodegenerativos, se sabe poco sobre las nanoformulaciones para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.El objetivo de este estudio fue desarrollar un sistema nanoparticulado de BNZ y evaluar su efectividad en formas de tripomastigotes y en la infección intracelular en células de mamíferos y células de miocitos cardiacos primarios. También se evaluó su efectividad en la infección por T. cruzi Nicaragua (TcN). En todos los casos se compararon los resultados obtenidos para las nanopartículas (NPs) con los obtenidos con el BNZ de partida.2. Materiales y métodos2.1. MaterialesBNZ (lote 9978 A; Laboratorios Elea, Buenos Aires, Argentina) fue provisto por el Instituto Nacional de Parasitología, ANLIS Malbrán, Ministerio de Salud de la Nación, (Buenos Aires, Argentina). El Lutrol® F-68 (P188) fue donado por BASF SE (Ludwigshafen, Alemania). Los reactivos empleados para los ensayos en células fueron comprados en Sigma Aldrich; el suero fetal bobino (SFB), la solución salina balanceada de Hanks (SSBH), y el medio de Eagle modificado (DMEM) fueron comprados en Gibco; el suero de caballo fue comprado en Internegocios SA (Córdoba, Argentina); las células epiteliales de riñon y células Vero fueron obtenidas de ABAC (Pergamino, Argentina). Todos los otros reactivos y productos químicos utilizados para fines analíticos eran de grado cromatográfico.2.2. Métodos2.2.1. Preparación de las nanopartículas de BNZLas NPs de BNZ fueron preparadas llevando a cabo una metodología de nanoprecipitación con posterior secado en liofilizador. Se empleó como estabilizante el Lutrol® F-68 (P188). Para esto el BNZ (en concentraciones de 5 a 26.2 mg/ml) previamente disuelto en etanol fue goteado sobre una fase acuosa contendiendo P188 (en concentraciones entre 5 y 50 mg/ml). El volumen final fue de 60 ml, mientras que la relación entre el volumen de fase orgánica y fase acuosa fue cambiando (de 10 a 25 %). La temperatura a la que se llevó a cabo el proceso de precipitación fue variando de 5 a 25 ºC, durante 60 minutos la suspensión se mantuvo en un agitador a paletas a diferentes velocidades (de 140 a 2000 rpm), y luego se extrajo el solvente orgánico por agitación magnética durante toda la noche. La suspensión obtenida fue centrifugada a 15000 rpm durante 20 minutos, el sobrenadante fue empleado para determinar la eficiencia de precipitación y el precipitado fue lavado 2 veces con agua destilada y posteriormente enfriado durante toda la noche a -20 ºC para ser liofilizado y obtener las NPs de BNZ.2.2.2. Diseño y optimización de la formulación de NPs de BNZSe formularon NPs de BNZ mediante el diseño de experimentos y la posterior optimización empleando el programa ?Design Expert?. Para ello se llevo a cabo una primera fase de screening utilizando como factores: la concentración de BNZ (CC BNZ), concentración de estabilizante (CC 188), el porcentaje de fase orgánica usada (FO), la velocidad de agitación (VA) y la temperatura de precipitación (Te). Las respuestas evaluadas fueron: el rendimiento obtenido (R), la eficiencia de nanoprecipitación (ENP), el tamaño de partícula resultante (TP) y la solubilidad aparente de BNZ en agua(S). Aquellos factores que resultaron ser significativos sobre alguna de las respuestas evaluadas fueron estudiados en la fase de optimización.2.2.3. Determinación del rendimiento y la eficiencia de nanoprecipitaciónEl R fue calculado como la relación entre el peso del producto obtenido y la suma de los pesos de todos los compontes como se muestra a continuación: 𝑅(%)=𝑚𝑔 𝑁𝑃𝑚𝑔 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜+𝑚𝑔 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠𝑥 100La ENP se calculó a partir de medidas de absorbancia en el sobrenadante (BNZ no precipitado) y la cantidad de BNZ de partida, empleando la siguiente ecuación: 𝐸𝑁𝑃(%)=𝑚𝑔𝐵𝑁𝑍 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎−𝑚𝑔 𝐵𝑁𝑍 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑔 𝐵𝑁𝑍 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑥 1002.2.4. Medidas del tamaño de partícula y potencial zetaPara determinar el tamaño y el potencial zeta de las NPs se realizaron experimentos de dispersión de luz dinámica empleando un ?Nano Particle Analyzer SZ-100?. Ambas medidas se hicieron sobre las NPs diluidas 60 veces en agua destilada.2.2.5. Determinación de la solubilidad aparente y ensayos de disoluciónAproximadamente 100 mg de las muestras se colocaron en un frasco con 5 ml de agua destilada. Esto se mantuvo en agitación orbital a 150 rpm durante 72 horas a 25 ± 2 ºC. Luego, el contenido de los frascos fue centrifugado para separar el BNZ disuelto de las NPs, y a los sobrenadantes se les determinó la cantidad de BNZ por absorbancia a 354 nm.Para los ensayos de disolución 100 mg de BNZ o la cantidad de NPs que contiene esa cantidad de fármaco se colocaron en 900 ml del medio (ácido clorhídrico 0.1 N). Se empleó el método de paletas para la agitación a 50 rpm y 37 ºC. A tiempos fijos se tomaron alícuotas (por triplicado) que luego de ser filtradas fueron usadas para determinar la cantidad de BNZ disuelto por medidas de absorbancia a 324 nm. Estos ensayos fueron llevados a cabo para el BNZ de partida, la nanopartícula de BNZ optimizada y una muestra similar no optimizada.2.2.6. Ensayos de toxicidad celularSe sembraron las células (1x 105) en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 ºC, aumentando las concentraciones de las NPs de BNZ (10, 25 y 50 μg/ml). La viabilidad de las células Vero (células epiteliales de riñón) fue determinada por la reducción de la sal de bromuro de difeniltetrazolio (desde amarillo) a su producto cristalino (azul). El color desarrollado se midió a 540 nm en un lector de microplacas (modelo 3550, Bio-Rad). Cada experimento se realizó por triplicado.2.2.7. Ensayos de hemólisisSe preparó una suspensión al 4% de sangre humana fresca desfibrinada en una solución estéril de glucosa al 5% y fue tratada con las NPs de BNZ (100, 50, 25 y 10 μg/ml) durante 24 horas a 37 °C. Después de la centrifugación, se determinó la absorbancia del sobrenadante a 540 nm para evaluar el porcentaje de hemólisis. Se utilizó BNZ de partida como referencia hemolítica y Triton X-100 como control positivo.2.2.8. Actividad antitripanosomalLos tripomastigotes de TcN, se obtuvieron a partir del cultivo de células Vero. El ensayo se realizó en microplaca estéril de 96 pocillos con 50.000 tripomastigotes por pocillo. Los cultivos se incubaron a 37 ºC durante 24 horas bajo una atmósfera de CO2 al 5% con 90 μl de DMEM medio fresco suplementado con 20% de SFB al 20% y 10% de sangre de ratón y con 10 μl de cada dilución del BNZ de partida y las NPs de BNZpara obtener la concentración deseada (de 5-100 μg/ml). La concentración de fármaco a la que se lisó el 50% de los parásitos (CL50) se calculó contando las células de acuerdo con el método Brener.3 Además, para detectar cualquier actividad antitriposomal potencial del excipiente, se llevó a cabo este estudio además utilizando solo P188. El ensayo se realizó por duplicado para cada uno de los tres experimentos.2.2.9. Preparación de miocitos ventricularesLos miocitos ventriculares se aislaron a partir de ratones de 5 días. Los fragmentos de corazón se disociaron con SSBH con tripsina al 0,02% a 37 ºC durante cuatro ciclos de 15 minutos cada uno. Las células se re suspendieron en DMEM con 10% de SFB y 10% de suero de caballo y se transfirieron a cubreobjetos de 12 mm contenidos en placas de cultivo de 24 pocillos. Estos cultivos se mantuvieron en una incubadora de CO2 al 5% a 37 ºC para permitir que las células se adhieran firmemente a los cubreobjetos.2.2.10. Ensayo de inhibición del crecimiento de amastigotesSe incubaron los miocitos cardíacos (MC) y células Vero en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en cubreobjetos de 12 mm como se describe en la sección anterior "Preparación de miocitos ventriculares". Después de 48 horas, las células cultivadas se infectaron con tripomastigotes de TcN (relación parásitos: células 10:1) y se incubaron durante 3 horas a 37 ºC en un 5 % de atmósfera de CO2. Después de lavar las células MC y Vero para eliminar los parásitos no internalizados, se incubaron con 10, 25 y 50 μg/ml de NPs BNZ durante 24 y 48 horas, respectivamente. Se retiraron los cubreobjetos, se lavaron con PBS, se fijaron en metanol y se tiñeron con Giemsa. En cada experimento, se evaluaron un total de 300 células para cada tratamiento seleccionadas aleatoriamente. El porcentaje de inhibición del crecimiento se calculó como se muestra a continuación: 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜(%)=𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒− 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑥 1002.2.11. Modelo animalOcho grupos, cada uno compuesto por 10 ratones hembra de 1 mes de edad, fueron inoculados intraperitonealmente con 1.000 tripomastigotes derivados del cultivo de TcN. Los ratones infectados se dividieron en los siguientes grupos: 1) ratones infectados sin tratamiento, 2) ratones tratados con BNZ de partida con dosis diarias de 50 mg/kg de peso corporal durante 15 días (2-17 días después de la infección), 3) ratones tratados con NPs de BNZ durante 15 días con dosis diarias de 50 mg/kg/día, 4) ratones tratados con NPs de BNZ durante 30 días con dosis diarias de 50 mg/Kg/día, 5) ratones tratados con NPs de BNZ durante 15 días con dosis diarias de 25 mg/kg/día, 6) ratones tratados con NPs de BNZ durante 30 días con dosis diarias de 25 mg/kg/día, 7) ratones tratados con NPs de BNZ durante 15 días con dosis diarias de 10 mg/kg/día, 8) ratones tratados con NPs de BNZ durante 30 días con dosis diarias de 10 mg/kg/día, y 9) ratones sin infección tratados con NPs de BNZ durante 30 días con dosis diarias de 50 mg/kg/día, como formulación de referencia. El BNZ de partida y las NPs de BNZ se dispersaron en aceite de oliva y se administraron a ratones a través de sonda oral. La sobrevida de los ratones se registró diariamente. Todos los procedimientos que involucran protocolos experimentales en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación ética y las entidades reguladoras establecidas en Argentina y fueron aprobados por el Comité de Bioética del Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben" (registrado RENIS Nº: 000028), y cumplió con las recomendaciones internacionales para el uso de animales de laboratorio (Asociación Médica Mundial en la Declaración de Helsinki).2.2.12. Métodos estadísticosLos datos estadísticos significativos (P