Diseño de alternativas sencillas para la determinación de la integridad de microorganismos: Determinaciones espectrofotométricas y bioelectroquímicas del consumo de la fuente de carbono en medios de cultivo

LUGO, T.J.; RIBONE, M. E.; FRANCESCHELLI, J.; MARCIPAR, I. S.; MORBIDONI, R. H.; LAGIER, C.M. *

La Plata

Congreso; VIII Congreso Argentino de Química Analítica; 2015

Asociación Argentina de Químicos Analíticos

El desarrollo de nuevas metodologías de diagnósticopara diferenciar individuos inmunizados de aquellos con infección activa estema de constante abordaje. La tuberculosis, infección causada por Mycobacterium tuberculosis, no se puedediagnosticar identificando anticuerpos (Acs) específicos, porque aún losindividuos sanos presentan dichos Acs, producto de la inmunización por elPrograma Nacional de Vacunación Obligatorio [1]. En ese caso, el estándar deoro es la detección del agente patógeno, aunque resulta complicada laconfirmación temprana de la infección, dado el largo tiempo de reproducción delmicroorganismo. Por ello, se han propuesto alternativas que utilizan otras micobacteriasrelacionadas, cuyos tiempos de duplicación son cortos, verificándose su capacidadde formación de colonias, indicativa de su integridad y sólo posible ante laausencia de M. tuberculosis en lamuestra original [2]. Siguiendo ese modelo, proponemos evaluar, en medio Middlebrook7H9, el consumo de glicerol, fuente de carbono utilizada por micobacterias. Diseñamosdos estrategias que permitirían evidenciar la presencia de micobacteriaspatógenas, verificando la concentración de glicerol por oxidación con la enzimaglicerol deshidrogenasa (GlDH), que utiliza cofactor NAD+.Una de las propuestas evalúa espectrofotométricamentela concentración de NADH. Se midió el incremento del cofactor reducido a tiempofijo de incubación y se obtuvieron curvas de calibrado. Las cifras de mérito resultaron:rango de linealidad, 1x10-5 M-5x10-4 M; límite dedetección, 8x10-5 M; sensibilidad analítica, 2,8 x 10-4 M-1.Un método alternativo consistió en laevaluación electroquímica de la concentración de glicerol, utilizandoelectrodos estampados de C modificados con la enzima GlDH. Se determinó elglicerol en medios de cultivo donde su concentración varió por consumodiferencial luego de incubar micobacterias íntegras, aptas para consumirlo, o imposibilitadaspor infección con bacteriofagos específicos. Los resultados obtenidos permitenvislumbrar una aplicación de esta metodología bioelectroquímica para facilitarel diagnóstico de infección activa por micobacterias.Referencias[1] Stella E., etal (2009) Rev. Argent. Microbiol. 4145-55..[2] McNerney, R. et al (2004) J. Clin. Microbiol.42, 2115?2120.