ESTUDIOS DE ACTIVIDAD CATALITICA Y DE DINÁMICA MOLECULAR DE UNA PROTEÍNA HÍBRIDA ENTRE METALO-β-LACTAMASAS DE TIPO B1 Y B2. INFLUENCIA DEL ENTORNO PROTEICO DEL SITIO ACTIVO

LISANDRO GONZÁLEZ; CINTIA STIVAL; DIEGO M. MORENO; ALEJANDRO J. VILA

Rosario

Congreso; XVIII CONGRESO ARGENTINO DE FÍSICOQUÍMICA Y QUÍMICA INORGÁNICA; 2013

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica (aaIFQ)

Introducción: El rápido crecimiento de la resistencia a antibióticos se ha transformado en un serio problema clínico para la salud humana. Uno de los antibióticos más empleados en el tratamiento de infecciones bacterianas son los β-lactámicos, que incluyen penicilinas, cefalosporinas y los más recientes carbapenemes. El principal mecanismo de resistencia bacteriana contra los mismos es la producción de β-lactamasas, enzimas que hidrolizan estos fármacos inactivándolos. Las metalo-β-lactamasas (MβLs) son un tipo de β-lactamasas de amplio espectro cuyo mecanismo de catálisis depende de Zn(II). Estas enzimas, para las cuales no se disponen de inhibidores clínicos, representan el principal grupo de carbapenemasas y se hallan diseminadas en diversos patógenos oportunistas. Las MβLs se dividen en 3 subclases B1, B2 y B3, que difieren en ciertas características estructurales de los sitios activos (cantidad de iones Zn(II) y algunos residuos de la primera esfera de coordinación), y sus entornos inmediatos (segunda esfera de coordinación y arreglo de bucles). Mientras que las enzimas B1 y B3 son de amplio espectro, las enzimas B2 son carbapenemasas exclusivas. Se ha postulado que el espectro reducido de sustratos de estas últimas podría corresponderse a la presencia de una inserción de secuencia sobre el sitio activo (ausente en B1 y B3), que altera la topología del mismo permitiendo sólo el ingreso de carbapenemes. Objetivos: En el trabajo actual se diseñó una proteína híbrida B1/B2 (SPM-1/SfhI)sustituyendo la secuencia de inserción de SPM-1 por la de la enzima B2, SfhI, con el fin de estudiar la incidencia de dicha inserción en el espectro de sustratos de estas enzimas. Se añadieron además 3 mutaciones puntuales para permitir que la inserción de SfhI interactuara correctamente con el entorno proteico de SPM-1, como lo hace en su enzima de origen. Resultados: Se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) para la proteína híbrida demostrando que esta enzima no confiere resistencia in vivo frente a distintos sustratos β-lactámicos (piperalicina, ceftazidima e imipenem). Estudios de dicroísmo circular revelaron que la proteína híbrida pura recombinante adopta un plegamiento soluble, con elementos de estructura secundaria y terciaria. La determinación del contenido metálico en la enzima corresponde a dos iones Zn por monómero. La determinación de los parámetros cinéticos (kcat y KM) contra distintos compuestos β-lactámicos reveló que la proteína quimera se comporta como una cefalosporinasa exclusiva. Se realizaron modelados por homología y estudios de dinámica molecular que corroboran la influencia de la inserción realizada en la actividad catalítica. Conclusiones: Los datos experimentales obtenidos junto a las simulaciones de dinámica molecular realizadas permiten suponer que una inserción de secuencia sobre el sitio activo de las enzimas MβLs altera el perfil de sustratos de las mismas dependiendo del contexto proteico en el que se involucre dicha inserción.