Loop mediated isothermal amplification as an alternative to Polymerase Chain Reaction

CHIRINOS ARIAS MICHELLE

Lima

Encuentro; Encuentro Científico Internacional; 2016

La tecnología de amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP) es una técnicarápida, simple, costo efectiva y específica. A diferencia de la PCR que se basa engradiente de temperatura, LAMP como su nombre lo indica, es una amplificación que seda a una temperatura constante en el rango de 60 a 65ºC (1), por lo que se puede realizar en un termobloque o en baño maría. Es decir, no es necesario el uso de equipos tancostosos como los termocicladores para obtener un alto nivel de precisión. Este tipo deamplificación requiere de la enzima Bst polimerasa (aislada de la bacteria Bacillusstearothermophilus) que aparte de polimerizar también tiene una gran actividad dedesplazamiento de hebra (1, 2). Está técnica usa cuatro pares de cebadores quereconocen seis regiones del ADN blanco y los productos de amplificación son estructurasde ADN tallo-lazo (stem-loop) con bastantes repeticiones invertidas de ADN blanco (3). Unpar de cebadores de 23 a 24 nucleótidos se encuentran en los extremos de la regiónblanco y reciben el nombre de F2c y B2, otro par de partidores se encuentranaproximadamente a 40 nucleótidos de los extremos del blanco y se les designa F1c y B1.Mientras que, otro par de iniciadores que se encuentran fuera de la región blanco se lesconoce como F3c y B3. El Forward Inner Primer (FIP) contiene al F1c, un espaciadorTTTT y la secuencia F2 complementaria a F2c. El Backward Inner Primer (BIP) contienela secuencia B1c (complementaria a B1), un espaciador TTTT y B2. La técnica LAMP esrápida, dura de 30 minutos a 1 hora, de bajo costo, los amplicones resultantes puedenser discriminados visualmente y detectados por precipitación usando pirofosfato demagnesio o visualizándolos agregando SYBR Green I luego de la reacción (1, 2, 4). Es mássensible que la PCR convencional y que la PCR en tiempo real (3), pues el rendimiento deestas técnicas se ve afectado por inhibidores presentes en las muestras orgánicas y laPCR es sensible a la contaminación. Por otro lado, LAMP requiere ser mejorada, pues esdifícil identificar los precipitados blancos a simple vista y el hecho de usar SYBR Green Iaumenta el riesgo de observar contaminaciones con otros amplicones que tambiénpuedan fluorescer (3). Sin embargo, Tomita et al.(5) ha logrado un mejor resultadoagregando a la reacción calceína, un metal indicador de fluorescencia y el iónmanganeso que permite observar si la reacción es positiva por cambio de color deanaranjado a verde fluorescente. En conclusión, debido a la alta especificidad, altasensibilidad y alta producción de amplicón en menor tiempo y con menor costo, LAMP esuna excelente alternativa a la PCR. El inconveniente principal de esta técnica es el diseñode los partidores específicos, pues se requiere personal especializado con conocimientosde bioinformática y programación, sobre todo si el método se usará para diagnóstico.