ROL DE LA ALMIDÓN SINTASA III DE Arabidopsis thaliana EN LA DEGRADACIÓN DEL ALMIDÓN

HEDIN, N.; MARTÍN, M.; CARRILLO, J.; GOMEZ-CASATI, DF; BUSI, MV

Zavalla, Santa Fe

Congreso; XV CONGRESO y XXXIII REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO; 2013

En plantas, se han identificado cinco clases de almidón sintasas (SS) que catalizan la transferencia de un residuo de glucosa desde ADP-glucosa al extremo no reductor de un glucano α-1,4 en crecimiento. En Arabidopsis thaliana, existe una única isoforma de cada familia; una unida a gránulo y requerida para la síntesis de amilosa, y cuatro formas solubles (SSI, SSII, SSIII y SSIV) asociadas principalmente a la síntesis de amilopectina. Todas las SS presentan alta identidad de secuencia en su extremo catalítico C-terminal, pero difieren notablemente en el dominio N-terminal lo que explicaría las diferencias en las funciones específicas de cada una de ellas.  La SSIII de A. thaliana (AtSSIII) posee un dominio C-terminal responsable de la actividad catalítica, y un dominio N-terminal que presenta tres dominios de unión a almidón (SBD por starch binding domains) no catalíticos en tándem, denominados D1, D2 y D3. Los SBD de AtSSIII, constituyen el primer ejemplo acerca de la existencia de un SBD en una enzima de síntesis de almidón ya que hasta el momento su presencia sólo se había informado en enzimas degradativas de almidón y glucógeno. Así, resulta de particular interés estudiar esta enzima ya que hemos comprobado que estos SBD modulan su actividad enzimática. Además, estudios llevados a cabo en plantas mutantes nulas de A. thaliana en el locus AtSS3, mostraron que estas plantas acumulan mayores cantidades de almidón, sugiriendo que AtSSIII tendría una función regulatoria negativa en la síntesis de almidón. Por ello,  decidimos estudiar la posible actividad degradativa de AtSSII. Dicha actividad fue ensayada a través de la técnica de overlay en dos condiciones: utilizando extractos crudos de células de E. coli que sobreexpresan a AtSSIII y con AtSSIII purificada a homogeneidad a partir de esos extractos. Trabajando de esta manera, se encontró que la muestra de AtSSIII purificada no presentó actividad mientras que sí lo hizo la enzima presente en el extracto crudo. Con estos resultados podemos concluir que la actividad degradativa de AtSSIII observada, podría deberse a posibles interacciones con otras enzimas presentes en el sistema de inducción, o a condiciones del entorno que sólo se encuentran presentes al ensayar el extracto crudo. Para continuar con el análisis, se buscaron in silico en bases de datos existentes aquellas proteínas de A. thaliana que interaccionan con la AtSSIII, mediante el servidor GeneMANIA, observándose que la Isoamilasa 1 (At2g39930) es una de ellas. Posteriormente mediante alineamiento de secuencias aminoacídicas vimos que la enzima desramificante de glucógeno en E. coli, GlgX, presenta un alto porcentaje de identidad de secuencia con la Isoamilasa 1. Finalmente comparamos el plegamiento global de ambas proteínas, GlgX e Isoamilasa 1 observando que dichas estructuras son similares. Los estudios bioinformáticos realizados sugieren  una posible interacción de AtSSIII con GlgX de E. coli, hecho que podría explicar la actividad degradativa observada en los extractos crudos de células de E. coli que sobreexpresan AtSSIII. A fin de comprobar esta hipótesis, realizamos  ensayos de pull down in vitro y las proteínas obtenidas están siendo analizadas  por MALDI-TOFTOF.