Libro de Actas. XI Congreso CYTAL. 2º Simposio internacional de nuevas tecnologías. “Hacia una mejora continua de la calidad”.

M. M. CARDOSO; R. M. MANZO; G. G. TONARELLI; A.C. SIMONETTA

Año: 2007 p. 10

El grupo mejor estudiado de bacterias Gram (+) con actividad antimicrobiana es el de las bacterias ácido lácticas (LAB), productoras de un gran número de bacteriocinas, cuya aplicación potencial como biopreservadores alimentarios se investiga y discute extensamente. Se seleccionó una cepa de Enterococcus faecalis de colección propia, previamente caracterizada como probable productora de una bacteriocina, y se procedió a la caracterización y purificación preliminar de esta sustancia. La cepa se propagó durante 24h a 37ºC en Caldo M17 (Difco). El sobrenadante libre de células se obtuvo centrifugando el cultivo, que luego se concentró 10 veces por evaporación bajo vacío y se esterilizó por filtración. Para proceder a su caracterización preliminar se determinó su actividad inhibitoria mediante el método de difusión en agar, frente a cepas bacterianas indicadoras Gram (+) y Gram (-), y también frente a cepas de diferentes hongos filamentosos y levaduras. Se evaluó además el efecto de los surfactantes no iónicos, catiónicos y aniónicos sobre la actividad inhibitoria del sobrenadante libre de células. Partiendo del sobrenadante parcialmente concentrado, la purificación se llevó a cabo empleando cromatografía de intercambio catiónico con resina SP-Sepharosa Fast Flow. Se eluyó con acetato de amonio a pH=4,5 en modo de gradiente escalonado desde 0,1 a 0,4 M, se juntaron fracciones de 5 mL y se les midió la absorbancia a 230 y 280 nm. Posteriormente la fracción activa se aplicó a una columna C18 (Waters, 35 cc); la elución se efectuó de modo escalonado con soluciones acuosas de acetonitrilo desde el 20% al 100% (v/v). A la fracción activa se la purificó parcialmente por HPLC, empleando una columna de fase reversa (C18) semipreparativa (Phenomenex, Júpiter Proteo, 250 x 10 mm, 10 µ, 90 Ǻ). La elución se realizó con un gradiente lineal de 2-80 % de acetonitrilo/agua (conteniendo 0.1 % TFA) en 30 min. Los compuestos activos en estudio mostraron un amplio espectro inhibitorio frente a bacterias Gram (+) y Gram (-), y a cepas de levaduras y de hongos filamentosos. El agregado de surfactantes al sobrenadante permitió aumentar la actividad antimicrobiana del mismo. La purificación con SP-Sepharosa permitió obtener una fracción retenida y activa. De la cromatografía en fase reversa se obtuvo una fracción activa con la elución del 20% (v/v) de acetonitrilo-agua. Por HPLC se consiguió separar dos fracciones activas. Los resultados sugieren la presencia de uno o más péptidos bioactivos de naturaleza hidrofílica y la conveniencia de utilizar intercambiadores catiónicos fuertes para la purificación de los mismos. Todas estas características hacen que estos compuestos presenten interés potencial como biopreservadores alimentarios.