Caracterización fisicoquímica parcial de los péptidos responsables de la actividad antioxidante y antihipertensiva presente en hidrolizados enzimáticos de proteínas de suero lácteo

ENRIQUE JOSÉ MAMMARELLA; FERNANDA MARINO; EMILSE CAMILA LÓPEZ; GUILLERMO ADRIÁN SIHUFE

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXI CONGRESO LATINOAMERICANO Y DEL CARIBE DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS & XVII CONGRESO ARGENTINO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS; 2019

La hidrólisis enzimática es una técnica ampliamente utilizada para la obtención de péptidos con propiedades biológicas, ya que permite controlar eficientemente la producción de sustancias bioactivas. Si bien es importante optimizar y producir péptidos bioactivos para su incorporación a productos alimentarios, también es fundamental conocer sus características fisicoquímicas. Por tales motivos, se llevó a cabo una hidrólisis enzimática de una solución de concentrado de proteínas de suero lácteo (WPC-80) empleando Alcalasa 2,4 L (EC 3.4.21.62) de Bacillus licheniformis y controlando parámetros fisicoquímicos (pH 9,25, temperatura 50°C, 100 rpm, relación enzima/sustrato 1/110). Luego de 216 min de reacción, el hidrolizado obtenido (29,1% de grado de hidrólisis, DH) fue congelado, liofilizado y preparado a diferentes concentraciones (10, 30 y 100 mg/ml) y valores de pH (6, 7 y libre por disolución en agua) para determinar la actividad antioxidante (AAO), empleando ABTS como agente redox, y la actividad antihipertensiva (AAH) utilizando el ensayo de inhibición de la enzima convertidora de angiotensina. Con el fin de caracterizar de forma parcial el hidrolizado obtenido y preparado a 40 mg/ml en buffer fosfato 50 mM (pH 7), se aplicaron técnicas cromatográficas con pre-tratamiento del mismo (centrifugación a 10000 x g a 4°C durante 10 min y posterior filtración en membranas de Nylon de 0,45 μm de diámetro de poro). Las cromatografías realizadas fueron: de filtración por geles (resina Sephadex G-25), de intercambio iónico (resinas DEAE-Sepharose, Q-Sepharose FF y SP-Sepharose FF) y de interacción hidrofóbica (resina Phenyl-Sepharose FF). En las fracciones recolectadas se determinó la absorbancia a 220 y 280 nm, se evaluó la presencia de actividad biológica y se analizaron los perfiles obtenidos por RP-HPLC. Los resultados indicaron que la hidrólisis enzimática permitió incrementar la bioactividad del WPC-80, siendo solo influenciada de forma directamente proporcional, en la mayoría de los casos, por el cambio de concentración. En cuanto a las técnicas cromatográficas, del análisis de los cromatogramas a 280 nm, se observó la complejidad fisicoquímica del mismo, lográndose un fraccionamiento por tamaño, carga e índice de hidrofobicidad. La determinación de la bioactividad de las fracciones presentó una asociación de la misma a péptidos de un peso molecular de 600 a 3000 Da y con múltiples cargas al pH en que se realizaron las cromatografías. En cuanto al carácter catiónico de los péptidos, los resultados indicaron que dicha propiedad fisicoquímica está más asociada de una forma estadísticamente significativa a la AAH que a la AAO. Los estudios de cromatografía de interacción hidrofóbica revelaron que las propiedades antioxidantes no se asociaron a sustancias altamente hidrofóbicas, resultando esto de interés, ya que permitió eliminar en un solo paso aquellos compuestos peptídicos asociados al sabor amargo en ciertos hidrolizados de proteína láctea. Finalmente, el análisis por RP-HPLC de las fracciones conseguidas, y en particular de aquellas que presentaron los valores más altos de actividad biológica, mostró que la misma está asociada a una elevada cantidad de compuestos peptídicos de mediana a baja hidrofobicidad (siendo necesario aproximadamente 15-30% de acetonitrilo en la fase móvil para su elución).