Caracterización de cultivos de una cepa de escherichia coli promisoria para la producción de hidrógeno a partir de glicerol crudo

SANCHEZ, E; GIORDANO, P.; WOOD, T.; COMELLI, R.A; BECCARIA, AJ

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología 2013 y II Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental.; 2013

CAM

El hidrógeno molecular (H2) es considerado un combustible muy promisorio, especialmente cuando es obtenido a partir de materiales biológicos. Algunas enterobacterias poseen una eficiente capacidad de producción a partir del glicerol. Cuando éste es obtenido como subproducto de la síntesis de biodiesel, puede ser directamente empleado en la formulación de medios de cultivo para el desarrollo de cepas productoras de H2. Escherichia coli es la especie bacteriana modelo en biotecnología. Si bien es capaz de metabolizar anaeróbicamente el glicerol, la producción de H2 es reducida. La aplicación de ingeniería metabólica y de diferentes estrategias de cultivo permite incrementar el consumo de glicerol y mejorar la producción de H2. El objetivo de este trabajo fue caracterizar cinética y estequiométricamente una cepa mutante de E. coli promisoria para la obtención fermentativa de H2 empleando un medio de cultivo previamente optimizado. Se empleó la cepa E. coli BW25113 frdC -control- que carece de actividad fumarato reductasa y una mutante de ésta (HW2) con una capacidad mejorada de producción de H2 a partir de glicerol. Las mismas se cultivaron en un medio de cultivo estándar (Hu y Wood, Biochem Biophys Res Commun 391; 2010, 1033) y en uno optimizado (Giordano et al., Bioresour Technol 101; 2010, 7537), ambos formulados con glicerol. Los cultivos se realizaron en anaerobiosis y se incubaron en agitación (45 rpm) a 30°C. Periódicamente se colectaron muestras de cada cultivo. En éstas se determinó la biomasa por densidad óptica a 600 nm. Además, se determinó la concentración de H2 y CO2 en el espacio de cabecera de los cultivos, mediante cromatografía gaseosa. En el caso de los cultivos realizados en el medio estándar, la velocidad específica de crecimiento () fue similar para ambas cepas (0,013 d-1). Sin embargo, la cepa HW2 presentó una densidad celular máxima (DCM) 27% superior al control, con un rendimiento de H2 (YH2/X) y de CO2 (YCO2/X) 2,5 y 3,9 veces superior al control, respectivamente. Por otra parte, en el medio optimizado, DCM y  fueron similares en los cultivos de ambas cepas. El YH2/X y YCO2/X para la cepa HW2 fue 2,2 y 1,9 veces superior que para la cepa control. En este último medio la DCM fue 5 y 3,5 veces superior para las cepas control y HW2, respectivamente, con respecto al medio estándar. También el desarrollo fue más rápido que en el medio estándar, donde  fue 13,5 y 11,5 veces superior para la cepa control y HW2, respectivamente. El YH2/X en el cultivo en medio estándar superó en 13,4 y 15,4 veces al obtenido en el optimizado, para la cepa control y HW2, respectivamente. Se pudo demostrar que la formulación de los medios de cultivo tiene una incidencia sobre los parámetros cinéticos y estequiométricos calculados. Además, sobre la base de la DCM y el YCO2/X, es necesaria una optimización específica del medio o condición del cultivo, que permita redireccionar el  metabolismo celular para mejorar el YH2/X.2) es considerado un combustible muy promisorio, especialmente cuando es obtenido a partir de materiales biológicos. Algunas enterobacterias poseen una eficiente capacidad de producción a partir del glicerol. Cuando éste es obtenido como subproducto de la síntesis de biodiesel, puede ser directamente empleado en la formulación de medios de cultivo para el desarrollo de cepas productoras de H2. Escherichia coli es la especie bacteriana modelo en biotecnología. Si bien es capaz de metabolizar anaeróbicamente el glicerol, la producción de H2 es reducida. La aplicación de ingeniería metabólica y de diferentes estrategias de cultivo permite incrementar el consumo de glicerol y mejorar la producción de H2. El objetivo de este trabajo fue caracterizar cinética y estequiométricamente una cepa mutante de E. coli promisoria para la obtención fermentativa de H2 empleando un medio de cultivo previamente optimizado. Se empleó la cepa E. coli BW25113 frdC -control- que carece de actividad fumarato reductasa y una mutante de ésta (HW2) con una capacidad mejorada de producción de H2 a partir de glicerol. Las mismas se cultivaron en un medio de cultivo estándar (Hu y Wood, Biochem Biophys Res Commun 391; 2010, 1033) y en uno optimizado (Giordano et al., Bioresour Technol 101; 2010, 7537), ambos formulados con glicerol. Los cultivos se realizaron en anaerobiosis y se incubaron en agitación (45 rpm) a 30°C. Periódicamente se colectaron muestras de cada cultivo. En éstas se determinó la biomasa por densidad óptica a 600 nm. Además, se determinó la concentración de H2 y CO2 en el espacio de cabecera de los cultivos, mediante cromatografía gaseosa. En el caso de los cultivos realizados en el medio estándar, la velocidad específica de crecimiento () fue similar para ambas cepas (0,013 d-1). Sin embargo, la cepa HW2 presentó una densidad celular máxima (DCM) 27% superior al control, con un rendimiento de H2 (YH2/X) y de CO2 (YCO2/X) 2,5 y 3,9 veces superior al control, respectivamente. Por otra parte, en el medio optimizado, DCM y  fueron similares en los cultivos de ambas cepas. El YH2/X y YCO2/X para la cepa HW2 fue 2,2 y 1,9 veces superior que para la cepa control. En este último medio la DCM fue 5 y 3,5 veces superior para las cepas control y HW2, respectivamente, con respecto al medio estándar. También el desarrollo fue más rápido que en el medio estándar, donde  fue 13,5 y 11,5 veces superior para la cepa control y HW2, respectivamente. El YH2/X en el cultivo en medio estándar superó en 13,4 y 15,4 veces al obtenido en el optimizado, para la cepa control y HW2, respectivamente. Se pudo demostrar que la formulación de los medios de cultivo tiene una incidencia sobre los parámetros cinéticos y estequiométricos calculados. Además, sobre la base de la DCM y el YCO2/X, es necesaria una optimización específica del medio o condición del cultivo, que permita redireccionar el  metabolismo celular para mejorar el YH2/X.