Expresión de la nucleoproteína del virus de la rabia en Escherichia coli

SGUAZZA GH; PECORARO MR; GALOSI CM; PICOTTO LD; CAVALITTO SF

Rosario

Congreso; XXIII Congreso latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología.,; 2016

Asociacion Argentina de Microbiologia

La rabia es una zoonosis viral que afecta a animales y generalmente se propaga al humano a través de mordeduras de perros infectados. Para lograr el control de la rabia, es importante el buen funcionamiento de sistemas de vigilancia de la circulación del virus y una vacuna eficaz que impidan la propagación del mismo. En Argentina, la elaboración de vacunas contra la rabia se hace en ratones lactantes y en cultivo celular, y tienen un gran riesgo operativo al manipular un virus altamente peligroso. La nucleoproteína viral es la proteína más conservada y actúa como superantígeno.El objetivo de este trabajo fue expresar y purificar la nucleoproteína del virus de la rabia en E. coli. Para ello, se extrajo el ARN viral de la cepa vacunal CVS-51 y se utilizó como molde para amplificar, mediante RT-PCR, la secuencia nucleotídica que codifica para la nucleoproteína. El producto de la RT-PCR fue comprobado por electroforesis en gel de agarosa, y posteriormente ligado al vector pQE-30, fusionado a una secuencia que codifica 6 residuos de histidina (His-tag) para facilitar la purificación de la proteína. La ligación fue confirmada mediante digestión con enzimas de restricción y PCR con primers específicos para la nucleoproteína. El plásmido obtenido fue utilizado para transformar E. coli (cepa M15) mediante electroporación. Las colonias recombinantes obtenidas fueron visibles en medio Luria Bertani suplementado con ampicilina y kanamicina. La transformación fue comprobada por PCR.Para confirmar la expresión de la nucleoproteína recombinante fusionada a los residuos de histidina (His-N), se realizaron cultivos en pequeña escala que fueron inducidos con IPTG durante cuatro horas. La purificación de His-N se llevó a cabo por cromatografía de afinidad a iones metálicos (IMAC). El nivel de expresión proteica fue evaluado mediante SDS PAGE, observándose una banda de aproximadamente 55 kDa correspondiente al tamaño predicho para His-N. Además, His-N mostró reaccionar de la misma manera que la nucleoproteína nativa cuando se la enfrentó a anticuerpos específicos en un ensayo de Western Blot.Los datos indican que la nucleoproteína recombinante puede ser expresada y purificada de manera sencilla. Dicha proteína podría ser utilizada como fuente segura de antígeno en la producción de sistemas aplicados al diagnóstico y de una vacuna a subunidades para la prevención de la enfermedad.