Optimización de la producción de una poligalacturonasa de Aspergillus Kawachii

GONZALEZ J; CHESINI, M; FRATEBIANCHI DE LA PARRA, D; ROJAS, N. L; CAVALITTO, S. F

La Plata

Simposio; 2do Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2012

CINDEFI - UNLP

Introduccón Entre los principales constituyentes de la pared celular de los vegetales se encuentran las sustancias pécticas, denominadas genéricamente pectina, que constituyen aproximadamente el 30 % del peso de la pared primaria de las fanerógamas. Las aplicaciones de las pectinas son numerosas. Las más relevantes se relacionan con su capacidad para formar geles y estabilizar emulsiones, suspensiones y espumas, empleándose en la industria de alimentos, cosmética y farmacéutica. Las enzimas que degradan pectina se denominan, genéricamente, pectinasas. Se las clasifica de acuerdo al modo de ataque sobre el homogalacturonano soluble. Las principales enzimas pécticas son las esterasas (como la pectin-metilesterasa (PE)) y las depolimerasas: las poligalacturonasas (PGasas), las pectin- y pectato-liasas (PL, PAL). Las PGasas hidrolizan ácido poligalacturónico sin esterificar o esterificado con diferentes grados de metoxilación.. Las pectinasas poseen varias aplicaciones en la industria de alimentos tal como la clarificación de jugos (manzana, uva). Aspergillus kawachii es un hongo filamentoso empleado tradicionalmente para la producción de shochu (aguardiente japonés) que se caracteriza por producir enzimas extracelulares con la propiedad de ser activas a pH más ácidos que sus equivalentes producidas por otros microorganismos. Una de las PGasas, denominada PG I, despertó gran interés debido a que mostró un máximo de actividad a pH 2,0 y posee actividad Protopectinasa. La actividad PPasa sobre protopectina de limón a pH 2,0-2,5 resultó estable a 50°C y fue capaz de solubilizar pectina de cáscaras de limón con aceptable rendimiento. Debido a que A kawachii produce muy poca cantida de PG1, el gen codificante de la enzima fue clonada en un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae ya que esta levadura ha demostrado ser un muy sistema de expresión de enzimas hidrolíticas fúngicas incluidas varias enzimas de Aspergillus kawachii y poligalacturonasas de otros orígenes. Teniendo en cuenta que las enzimas producidas tienen un mercado directo en la industria alimentaria, la categoría de GRAS de S. cereviciae es una ventaja adicional. De los sistemas de cultivo tradicionales, el batch alimentado ha resultado ser el más conveniente para la obtención de altas concentraciones celulares y, la capacidad del mismo de permitir controlar la velocidad de crecimiento de los microorganismos, lo convierten enla mejor alternativapara la producción de proteínas heterólogas. Materiales y métodos Los cultivos se realizaron en un fermentador de 1,5 l de capacidad máxima; New Brunswick, Bioflo 350 con control de O2 disuelto y pH. Se empleó un medio sintético conteniendo glucosa como fuente de carbono y energía (FCE) y urea como fuente de nitrógeno (FN). La cepa que se utilizó en los ensayos fue el clon de S. cerevisiae conteniendo el vector inducible pYES2:PG1DI. La alimentación de los cultivos se realizó con el mismo medio concentrado con glucosa (en la etapa de acumulación de biomasa) o con glucosa/galactosa en la etapa de inducción. Se estudio la expresión realizando dos perfiles de alimentación cambiando la concentración de glucosa y dos perfiles de inducción cambiando la velocidad de flujo. Se alimento con 100 g/l y con 300 g/l de glucosa a un flujo de 26 ml/h y se indujo alternativamente con 100g/l de glucosa y 50 g/l de galactosa a una velocidad de 9 ml/h y 27 ml/h respectivamente.   Resultados: En las figuras 1 y2 puede observarse las curvas de acumulación de enzima utilizando los tres primeros perfiles de inducción/alimentación, 1 o 2 pulsos de galactosa sola (Fig1) o una alimentación doble (Glu/Gal) en una relación 100/20 (g/l..                               En las figuras 3 y 4 se puede observar los perfiles de acumulación de PG1 cuando se realiza una alimentación/inducción con mayor concentración de galactosa (45g/l) o cuando se realiza la alimentación inducción en dos fases, primero una alimentación a fin de acumula biomasa y luego una alimentación doble (glu/gal) para inducir la expresión de la enzima     Conclusiones: Puede observarse que la estrategia de acumular biomasa en una primera fase de alimentación sólo con glucosa e inducir luego con una mezcla de glucosa y galactosa resulta ser la opción más ventajosa si lo que se pretende es obtener la mayor concentración de enzima