Extracto acuoso de yerba mate: novedoso sustrato para la cuantificación de clorogenato hidrolasa

BUTIUK, A.P.; HOURS, R.A.; MIGNONE, C.

La Plata

Encuentro; V Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones; 2012

Sociedad Argentina de Biocatálisis y Biotransformaciones

Extracto acuoso de yerba mate: novedoso sustrato para la cuantificación de clorogenato hidrolasa   Ana P. Butiuk, Roque A. Hours, Carlos F. Mignone butiuk@biotec.org.ar Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI; UNLP, CONICET La Plata). Fac. de Cs. Exactas, UNLP. 47 y 115, (B1900ASH) La Plata, Argentina   La enzima clorogenato hidrolasa (CHasa, EC 3.1.1.42) cataliza la hidrólisis del ácido clorogénico (ACG), liberando cantidades equimolares de ácido quínico y cafeico. El ACG es un polifenol natural de alto valor comercial con diferentes aplicaciones en las industrias de alimentos y farmacéutica. Tradicionalmente, se ha reconocido a ciertos derivados del café y a otros extractos vegetales como ricos en ACG. Sin embargo, recientemente se ha reportado que su contenido en yerba mate (Ilex paraguarienses A. St. Hil) es substancialmente mayor y del orden de 10% en base seca [1]. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el uso de un extracto acuoso concentrado de yerba mate (EYM) con un contenido en sólidos totales de 215 g/l y de ACG de 71 g/l (generosamente provisto por La Cachuera S.A., Misiones, Argentina) como sustrato alternativo para la cuantificación de actividad CHasa en reemplazo del ACG comercial (Sigma), cuyo costo actual es 250 US$/g. El extracto enzimático (EE) se obtuvo a partir de una cepa de A. niger cultivada en medio Czapek modificado (pH 7), suplementado con EYM como inductor de la actividad CHasa, en frascos agitados (180 rpm, 30 ºC) durante 48 h. La biomasa obtenida fue separada, lavada y desintegrada en buffer fosfato de sodio (NPB, pH: 6,5). La suspensión resultante fue centrifugada y el sobrenadante obtenido fue utilizado como EE. La determinación de la actividad de CHasa se hizo con el método de Okamura y Watanabe [2] modificado, utilizando como sustratos el ACG comercial (tradicional) y el EYM (alternativo) midiendo el cambio de A350 (máximo para el ACG). Las variables analizadas fueron: concentración de sustrato, concentración de enzima y tiempo de reacción. La unidad de actividad CHasa se definió como la cantidad de enzima que hidroliza 1 µmol de ACG por minuto bajo las condiciones de ensayo. De los resultados obtenidos se proponen las siguientes condiciones de reacción: a) sustrato (250 µl): ACG comercial (1,5 mM en NPB 0,05 M) o EYM (0,75% en NPB 0,05 M), b) tiempo de reacción 5 min (para ambos sustratos) y c) temperatura 30°C. En estas condiciones, el cambio de A350 es lineal hasta 3,0 unidades de CHasa en la mezcla de reacción usando, tanto el ACG comercial y como el EYM como sustrato. A partir de estos resultados, y considerando el elevado costo del ACG comercial, se puede concluir que el EYM resulta un novedoso y económico sustrato para la cuantificación de la actividad de CHasa. Bibliografía 1. Isolabella, S.; Cogoi, L.; Lopez, P.; Anesini, C; Ferraro, G.; Filip, R. Food Chem. 2010, 122, 695-699. 2. Okamura, S.; Watanabe, M. Agric. Biol. Chem. 1982, 46, 297-299.