PRODUCCIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA INULINASA PRODUCIDA POR ASPERGILLUS KAWACHII EN CULTIVOS LÍQUIDOS SUMERGIDOS

N.L. ROJAS; CHESINI, M.; CAVALITTO, S; HOURS R.A.

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología; 2011

Las inulinasas microbianas o β-(2→1) fructanohidrolasas son enzimas que hidrolizan enlaces β-(2→1)fructano en la inulina y se utilizan para la producción de jarabe de fructosa, oligofructosacáridos y etanol o acetona-butanol a partir de residuos de especies vegetales. Estas enzimas pueden clasificarse en exo y endoinulinasas. Las exoinulinasas (β-D-fructan fructanohidrolasa) hidrolizan los enlaces β(2→1) de la mólecula de inulina y separan sucesivamente unidades de frutosa y las endoinulinasas (2,1-β-D fructan fructanohidrolasa) hidrolizan los enlaces internos β(2→1) de la molécula de inulina y dan como producto final un mezcla de oligofructosacáridos. El objetivo de este trabajo fue purificar y caracterizar la enzima responsable de la actividad inulinasa de A. kawachii en medio líquidos. Se realizaron cultivos de A. kawachii IFO 4308 en medio líquido con inulina como fuente de carbono y energía a 30ºC durante 72h. Después de concentrar a presión reducida el sobrenadante, se procedió a la purificación de la enzima utilizando las siguientes técnicas cromatografícas: desalado (Sephacryl G25), intercambio iónico (Sepharosa Q), filtración en gel S100 (Sephacryl S100). Se determinó el modo de acción de la enzima por cromatografía en capa fina, el peso molecular mediante SDS-PAGE, el punto isoeléctrico mediante isoelectroenfoque, el pH óptimo en el rango de 2,6 a 7 y la estabilidad térmica de la inulinasa a 50º C, 55º C, 60º C y 70º C a pH 5. La actividad inulinasa máxima detectada fue de 0,0455 U/ml a las 68 h de cultivo utilizando un medio semi sintetico en las condiciones planteadas. A partir del protocolo de purificación propuesto fue posible obtener una fracción homogénea de proteína con actividad inulinasa, obteniéndose una recuperación del 61,6% y 10,1 veces de purificación. Se determinó que la enzima purificada presenta actividad exo-inulinasa. Su peso molecular estimado fue de 54±1 kDa y el punto isoeléctrico de 3,2±0,2. La inulinasa presentó un pH óptimo de 5, conservándose un 70% de actividad entre 4 y 6. Cabe resaltar que a valores de pH tan bajos como 3 se mantiene un 50% de actividad enzimática. Los experimentos realizados para determinar la estabilidad térmica de la inulinasa revelaron que es estable por al menos 150 min a 55º C y retuvo más del 60% de la actividad durante el mismo tiempo a 60º C. Sin embargo, a 70º C se observó una pérdida total de la actividad enzimática. Debido a estas interesantes características bioquímicas, esta enzima ofrece interesantes perspectivas en vista del crecimiento de la producción de jarabes de fructosa puros a partir de inulina. El clonado y sobreexpresión del gen que codifica para esta enzima esta actualmente en desarrollo.