Purificación de una poligalacturonasa producida por Pichia anomala aislada en la Provincia de Misiones, Argentina

MARTOS, M.A.; ROJAS, N.L.; BUTIUK, A.P.; ZUBRESKI, E.R.; HOURS, R.A.

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología; 2011

Sociedad Argentina de Micología

Pichia anomala, una levadura autóctona aislada de frutas cítricas, posee un sistema pectolítico constituido fundamentalmente por una enzima con actividad poligalacturonasa (PG). Esta enzima también posee actividad protopectinasa o capacidad macerante de tejidos vegetales (papa, mandioca y zanahoria). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un protocolo simple y de alto rendimiento para la purificación de esta enzima a partir de sobrenadantes de cultivos de P. anomala desarrollados en medio líquido. Para la obtención de los extractos enzimáticos, se realizaron cultivos a escala de frascos agitados (180 rpm), a 30 ºC, durante 10 h, en un medio de cultivo compuesto por Yeast Nitrogen Base, glucosa y pectina. Luego de separar la biomasa por centrifugación, el sobrenadante fue concentrado 20 × (SC) y fue utilizado para evaluar dos procedimientos de purificación. En el procedimiento 1, el SC fue desalinizado mediante cromatografía en columna rellena con Sepharosa® G-25. La fracción con actividad PG, libre de sales, fue sometida a una cromatografía de intercambio aniónico (Sepharosa® Q FF). Las fracciones que contenían actividad PG fueron liofilizadas y desalinizadas y sometidas a una cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl® S100 HR). En el Procedimiento 2, el SC fue dializado y posteriormente sometido  a una cromatografía de intercambio catiónico (Sepharosa® SP FF). Luego de cada paso cromatográfico, las muestras se analizaron en términos de actividad enzimática, mediante determinación de los grupos reductores liberados (Somogy-Nelson), de cantidad de proteínas (Bradford) y de pureza (SDSPAGE). Mediante el procedimiento 1 se obtuvo una única fracción con actividad PG,  resultando en una recuperación del 21 % de la actividad original; mientras que mediante el procedimiento 2, se recuperó el 56 % de la actividad PG original lográndose un incremento de la actividad específica de 1,3 veces. Las proteínas obtenidas a partir de ambos procesos de purificación, presentaron una sola banda cuando fueron analizadas por SDS-PAGE. A partir de estos resultados y considerando la simpleza del procedimiento 2, es posible concluir que este proceso puede ser considerado para una futura producción de PG a escala industrial ya que permitió obtener buenos rendimientos de la enzima en un proceso de solo dos etapas.