CIDCA   05380
CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO EN CRIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Construcción de anticuerpos simple cadena multiméricos y expresión temporal en hojas de Nicotiana benthamiana
Autor/es:
CAFIERO, HILARIO; PETRUCCELLI, SILVANA
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; XXIX Reunión Argentina de Fisiología Vegetal; 2012
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal (SAFV)
Resumen:
Las plantas son el sistema de producción de proteínas más económico y seguro, además de poseer la capacidad de sintetizar moléculas de estructura compleja, como por ejemplo anticuerpos. La expresión de fragmentos de anticuerpos simple cadena (scFv) en plantas se ha focalizado en la expresión de formas monoméricas, pero para muchas aplicaciones es importante contar con moléculas de avidez incrementada como multímeros de scFv. Estas formas son difíciles de producir en los sistemas de expresión habituales. El objetivo de este trabajo fue estudiar la expresión de scFv multimerizados en células vegetales. Para generar los multímeros del scFv 2G3, específico de transglutaminasa tisular humana, se desarrolló una estrategia de clonado iterativo. El scFv 2G3 fue amplificado por PCR con primers que agregan sitios PflMI y BglI en los extremos del mismo, al igual que la secuencia bisagra de una IgA humana para evitar que la multimerización afecte el reconocimiento del antígeno. El producto obtenido fue clonado en el vector pCR 2.1. Este plásmido fue linearizado con las enzimas HindIII y PflMI para generar el receptor, y digerido por otro lado con las enzimas HindIII y BglI para generar el inserto de scFv. Debido a la particularidad de los sitios de reconocimiento de PflMI y BglI, al producirse la ligación se generó un dímero que no contenía los sitios de reconocimiento de las enzimas en el sitio interno de ligación, lo que permitió repetir el ciclo para generar un trímero. Los multímeros obtenidos fueron subclonados en el vector pCR8GW y luego en el vector binario pGWB2 empleando clonasas LR. Con estos plásmidos se transformó A. tumefaciens GV3101 y se agroinfiltraron hojas de N. benthamiana junto con el supresor de silenciamiento P19. Cuatro días postagronifiltración se realizó una extracción proteica que fue analizada por Western blot, detectando que los multímeros de scFv se expresaban correctamente.