CIDEPINT   05376
CENTRO DE INVESTIGACIONES EN TECNOLOGIA DE PINTURAS
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Método de cuantificación intracelular de 2-hidroxietidio mediante cromatografía líquida en gradiente
Autor/es:
PABLO J. LEBED; JAIVER OSORIO GRISALES; JAVIER GOTTA; SONIA KEUCHKARIAN; MIRIAM GIAMBELLUCA; CECILIA B. CASTELLS
Lugar:
Bahía Blanca
Reunión:
Congreso; V Congreso Argentino de Química Analítica; 2009
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Químicos Analíticos
Resumen:
Las especies reactivas de oxígeno son generadas fisiológicamente en pequeñas cantidades durante la fosforilación oxidativa y además son generadas por los leucocitos polimorfonucleares durante el estallido oxidativo. Dado que estas especies tienen vida media muy corta, el análisis directo es complejo por lo cual se utilizan técnicas indirectas para detectar estos radicales in vitro e in vivo. Dentro de ellas, las sondas fluorescentes son herramientas ampliamente utilizadas para detectar especies reactivas de oxígeno dado que proveen una buena resolución espacio-temporal así como un amplio rango dinámico además de ser fáciles de utilizar y de bajo costo. La hidroetidina (HE) ha sido utilizada como sonda para detectar específicamente la producción de radical superóxido intracelular mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo en diferentes tipos de células y tejidos. Recientemente, se ha descubierto que el producto de reacción entre hidroetidina y el radical superóxido es el 2-hidroxietidio(2-OH-E+) y no etidio(E+) como se pensaba previamente, y que este ión no podría obtenerse por la acción de otros oxidantes intracelulares [3]. Este ión específico tiene una estructura química que difiere del etidio en un átomo de oxígeno, por lo cual ambos iones tienen un espectro de fluorescencia similar lo que implica una seria limitación al momento de interpretar correctamente datos cualitativos y cuantitativos basados en técnicas fluorescentes. Por esta razón, se han sugerido métodos con un paso de separación previo por cromatografía líquida o técnicas de electromigración. Los métodos por HPLC incluyen condiciones de elución de fase reversa asociados a detectores de fluorescencia o electroquímicos. Sin embargo, los métodos propuestos en la literatura exhiben una baja resolución entre los dos picos fluorescentes, lo cual no sería suficiente para la detección de niveles traza de 2-OH-E+, y todos ellos exhiben tiempos de análisis en el rango de 20-30 minutos, lo cual no es adecuado para análisis de rutina. En este estudio, reportamos la optimización de la resolución 2-OH-E+/E+ con una tiempo de análisis corto utilizando columnas de C18 o fenilo y condiciones de elución en gradiente. Se determino la repetibilidad, rango lineal y límites de detección y cuantificación de 2-OH-E+. Se discute la aplicación del método optimizado a la medición de 2-OH-E+ intracelular en neutrófilos humanos de individuos sanos.