Modelado de la retención y selectividad de compuestos ionizables en función del pH de la fase móvil y la temperatura en cromatografía líquida en fase inversa (RPLC)

GAGLIARDI, L. G; C. B. CASTELLS; RÀFOLS, C.; ROSÉS, M.; BOSCH, E.

Iquique, Chile

Congreso; VIII Encuentro de Química Analítica y Ambiental; 2006

Comité Organizador Congreso

El desarrollo de un método cromatográfico tiene como objetivo la búsqueda de las condiciones experimentales óptimas para mejorar una separación. Esta búsqueda implica un compromiso entre la obtención de una resolución apropiada de los compuestos de interés en el menor tiempo de análisis posible. La rutina más difundida para optimizar separaciones consiste en la prueba y error luego de un número de experimentos que depende de la experiencia previa del analista. Otra aproximación al problema consiste en desarrollar algún modelo que permita interpretar teóricamente las consecuencias de modificar las variables experimentales más relevantes sobre los equilibrios involucrados en la retención. Esta estrategia, totalmente diferente, lleva a desarrollar ecuaciones, termodinámicamente consistentes, que permitan una predicción precisa de los factores de retención y de separación cromatográfica en función de las variables experimentales involucradas. Como desventaja, el tratamiento matemático adquiere mayor compejidad a medida que aumenta el número de equilibrios coexistentes, ademas del equilibrio vinculado al fenomeno de retención, en este caso de hidrofobicidad. Actualmente, la influencia de variables tales como tipo y composición de la fase móvil y fase estacionaria sobre la retención de moléculas neutras está considerablemente avanzado. También el efecto de la temperatura sobre la retención moléculas neutras ha sido ampliamente discutida observándose, en general, un aumento en la eficiencia cromatográfica por disminución en la viscosidad del solvente y aumento en la velocidad de difusión del soluto y reducción de los tiempos de análisis al calentar. Pero en el caso de solutos ionizables la relación entre su retención y la temperatura no ha sido estudiada. La separación por RPLC de estos analitos depende fuertemente del pH de la fase móvil. Los modelos desarrollados y experimentalmente corroborados predicen una dependencia sigmoidal de la retención (en escala logarítmica) y el pH, y con un punto inflexión que corresponde al pKa del analito. Sin embargo, todos estos estudios han sido conducidos en condiciones isotérmicas, y la influencia de la temperatura sobre estos sistemas cromatográficos ha sido muy poco estudiada. En un sistema RPLC, y si se regula el pH a un valor cercano al del pKa del analito, la dependencia de la ionización del buffer y del analito con la temperatura puede ser usado para mejorar la separación de ácidos y bases débiles. En este trabajo hemos derivado una ecuación general para la predicción de la retención de compuestos ionizables simultáneamente en función del pH de la fase móvil y la temperatura de la columna. Para la predicción de la retención en todo el rango de pH y temperaturas, se requieren de los datos de retención obtenidos a partir de cuatro experiencias, realizadas a dos pH extremos y a dos temperaturas, respectivamente. Las ecuaciones fueron derivadas a partir de la termodinámica fundamental que rige a los equilibrios químicos involucrados. El estudio destaca la importancia de elegir adecuadamente el compuesto a utilizar como tampón en función de la naturaleza del analito  que se desea separar, asi como tambien la predecibilidad y magnitud potencial del efecto de temperatura sobre los factores de selectividad, incluso orden de elución de los picos cromatográficos en RPLC.