Nanosistemas liposomales de aplicación tópica con penetración cutánea y actividad antitumoral

TEMPRANA F.; CALIENNI N.; ALONSO S.; LLOVERA R.; MONTANARI J.

Buenos Aires

Jornada; Estado actual de la Nanotecnología y sus aplicaciones en las Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas; 2017

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

Resumen: Se encapsularon dos fármacos con propiedades antitumorales en liposomas ultradeformables con el fin de desarrollar nuevos tratamientos de aplicación tópica. Los principios activos elegidos fueron el 5-Fluorouracilo (droga clásica) y el Vismodegib (droga de última generación). Ambos son utilizados durante la terapia contra algunos tipos de cáncer de piel, mediante administración parenteral con severos efectos secundarios no deseados. Los nanosistemas obtenidos fueron caracterizados fisicoquímicamente, se determinó su capacidad para penetrar la piel, y su toxicidad o actividad antitumoral in vitro en una línea celular derivada de queratinocitos humanos no tumoral y en una línea de origen melanómico. Por último, se estudió el efecto de la co-encapsulación del 5-Fluorouracilo con un extracto natural de arándanos.Introducción: El 5-Fluorouracilo (5FU) es una droga que se usa desde hace más de 40 años en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, incluyendo algunos tipos de neoplasias de la piel. El Vismodegib (Vis) es una droga de última generación recientemente aprobada por la Food and Drug Administration de EE.UU., utilizada en el tratamiento de adultos con carcinoma de células basales. Si bien ambos principios activos han demostrado ser efectivos para revertir los eventos neoplásicos, presentan numerosos y severos efectos secundarios cuando son administrados por la vía parenteral. Por lo tanto, la encapsulación del 5FU y el Vis dentro de nano-drug delivery systems permite reducir los efectos secundarios y realizar una entrega sitio-específica en la zona del tumor.Se seleccionó como nanosistema a los liposomas ultradeformables (UDL), porque son la única clase de liposomas capaces de penetrar el estrato córneo de la piel y liberar su contenido en la epidermis viable y dermis1. Su elevada deformabilidad a temperatura ambiente y corporal se debe a las características físico-químicas que le aporta la presencia de la sal biliar colato de sodio en combinación con la fosfatidilcolina de soja. Se llevó a cabo una exhaustiva caracterización físico-química de los nanosistemas con 5FU (UDL-5FU) y Vis (UDL-Vis). En el caso del 5FU, además, se co-encapsuló un extracto etanólico de arándanos (Vaccinium myrtillus) (UDL-5FU-EA), dado que existe evidencia de que su co-encapsulación con flavonoides produce un efecto sinérgico antitumoral2.Para el caso de UDL-5FU y UDL-5FU-EA, se estudió la actividad antitumoral in vitro mediante diversas técnicas, comparando su efecto en dos líneas derivadas de piel humana: HaCaT, proveniente de queratinocitos inmortalizados (no tumoral) y SK-Mel-28, derivada de melanoma (tumoral). Se estudió la penetración de UDL-5FU y UDL-Vis en piel humana en condiciones ex vivo, en las cuales se simularon las condiciones in vivo de aplicación, tales como el gradiente de humedad transdérmico y la temperatura de la piel. Materiales y métodos:Obtención y caracterización de los nanosistemas: Los UDL fueron preparados a partir de la resuspensión con buffer Tris de un film lipídico de fosfatidilcolina de soja y colato de sodio que se formó mediante rotoevaporación3. El extracto fue obtenido a partir de arándanos disgregados a los cuales se les realizó una extracción con etanol ácido, eliminado por rotoevaporación4. El 5FU y el extracto de arándanos fueron añadidos durante la hidratación del film. Mientras que el Vis se añadió durante la formación del film lipídico. Los UDL-5FU y UDL-5FU-EA fueron sonicados, mientras que UDL-Vis extrudados por una membrana de 100 nm de tamaño de poro, con el fin de obtener en todos los casos vesículas unilamelares de alrededor de 100 nm de tamaño. La droga no encapsulada fue removida mediante cromatografía de exclusión molecular. Se estudió su tamaño y estabilidad en el tiempo mediante dynamic light scattering, potencial-Z y microscopía electrónica de transmisión. Se determinó la interacción de los principios activos con la membrana liposomal mediante calorimetría diferencial de barrido y se llevaron a cabo estudios de la deformabilidad de las formulaciones.Actividad antitumoral e internalización: Los estudios in vitro se realizaron en las líneas celulares HaCaT y SK-Mel-28. Se determinó la citotoxicidad de UDL-5FU y UDL-5FU-EA mediante MTT, cristal violeta y rojo neutro a las 4 y 24 hs de tratamiento. Se determinó la inducción de apoptosis y necrosis mediante citometría de flujo luego de 6 hs de incubación, mediante el kit de detección con Anexina V-FITC. Por último, se estudió la internalización de las formulaciones marcadas fluorescentemente a 4 y 37ºC.Penetración en piel: Se estudió la capacidad de UDL-5FU y UDL-Vis para atravesar el estrato córneo de la piel humana mediante el Modelo de Penetración de Saarbrücken en condición no oclusiva5. En el caso del 5FU se cuantificó por espectrometría UV-Vis, mientras que el Vis mediante HPLC, a distintas profundidades en el estrato córneo, luego de someter a la piel a la técnica de tape stripping5. Además, se estudió el perfil de penetración de los UDL-5FU marcados con dos sondas fluorescentes mediante microscopía confocal de cortes histológicos y z-stacking de un fragmento intacto de piel.Resultados:Actividad antitumoral: UDL-5FU y UDL-5FU-EA mostraron efectos citotóxicos semejantes entre sí. Si bien afectaron tanto a la línea tumoral como la no tumoral, incrementaron de manera significativa el efecto citotóxico del 5FU en SK-Mel-28 después de 24 hs de tratamiento. Sin embargo, SK-Mel-28 mostró una mayor internalización de ambas formulaciones en comparación a HaCaT a 4 y 37ºC, y a partir de los estudios de apoptosis se observó un efecto diferenciado entre ambas líneas. Después de 6 hs de incubación UDL-5FU y UDL-5FU-EA indujeron un elevado porcentaje de apoptosis sólo en la línea tumoral y mayor que el de 5FU libre. Sin embargo, UDL-5FU-EA incrementó el porcentaje de células necróticas en HaCaT en comparación con UDL-5FU y 5FU libre.Penetración en piel: Tanto UDL-5FU como UDL-Vis lograron atravesar el estrato córneo de la piel, detectándose tanto 5FU como Vis en la epidermis viable y dermis. Sin embargo, el Vis fue hallado en mayor proporción en el estrato córneo (ambiente hidrofóbico), mientras que el 5FU se encontró en mayor proporción en la epidermis viable y dermis (ambiente más hidrofílico). Conclusión: Se obtuvieron formulaciones liposomales estables que encapsulan 5FU y Vis, capaces de penetrar la piel humana intacta en menos de una hora. En el caso de la formulación con 5FU además se observó que presenta efecto antitumoral in vitro. La co-encapsulación del 5FU con un extracto etanólico de arándanos no modificó su actividad antitumoral, sin embargo, produjo una inducción de necrosis no deseada en la línea celular de queratinocitos humanos no tumoral.Referencias:1Cevc & Blume (1992), Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes,1104(1) 226-2322Cosco D., et al. (2015) International journal of pharmaceutics, 489(1):1-103Montanari J., et al. (2007), International journal of pharmaceutics, 330(1):183-944Montanari J., et al. (2013), Journal of cosmetic science, 64 (6), 469-4815Montanari J., et al. (2010) Journal of Controlled Release,147(3):368-76Agradecimientos: Roche Argentina por la donación del Vismodegib para poder llevar a cabo este trabajo.