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El empleo de los polimorfismos del ADN mitocondrial para caracterizar a las poblaciones humanas ha permitido distinguir patrones geográficos de distribución de linajes, detectando posibles rutas de poblamiento. En Argentina existen regiones clásicamente identificadas como libres de pueblos originarios, quedando espacios vacíos de información en cuanto a la distribución de linajes nativos. Sin embargo, los pueblos de las regiones del centro-oeste y noroeste no fueron exterminados sino que fueron asimilados biológicamente primero a la sociedad colonial y luego a la sociedad estatal. Los procesos de mestizaje tuvieron una tendencia sexo asimétrica, permitiendo la conservación de los linajes maternos nativos en elevadas proporciones. En este trabajo se analizan 1951 muestras obtenidas en centros de salud de catorce localidades del centro-oeste y noroeste de Argentina y se comprueba que el 90 % de los haplogrupos mitocondriales son propios de América. La agrupación de localidades en base a la distribución de frecuencias de haplogrupos nativos mediante AMOVA indica que las localidades de Maimará y La Quiaca constituyen una entidad claramente diferenciada, en coincidencia con los datos arqueológicos y lingüísticos. Las elevadas frecuencias de haplogrupo D en La Rioja y de haplogrupo A en Villa Tulumaya pueden representar fenómenos poblacionales prehispánicos. Se postula entonces la utilidad de abordar a la población actual como vía de acceso al conocimiento del origen de los linajes mitocondriales nativos y su distribución espacial.