Rearreglo complejo del F8 asociado a defectos en la replicación del ADN por "fork stalling-template switching" (FoSTeS) como causa de Hemofilia A severa sin inhibidor

ABELLEYRO MM; LC ROSSETTI, T TETZLAFF, CP RADIC, VD MARCHIONE, IB LARRIPA, ; DE BRASI CD

Mar del Plata

Congreso; LX Reunión Científica Anual de la SAIC; 2015

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Las grandes deleciones ylos rearreglos complejos del F8 soncausa de hemofilia A severa (HAs) y predisponen al desarrollo de inhibidoresterapéuticos, anti-FVIII. Este trabajo presenta la caracterización molecularcompleta de un gran rearreglo complejo del F8(compuesto por la concurrencia de 3 deleciones, 2 inserciones y 1 inversión)detectada por ausencia consistente de amplificación del promotor y el exón 1del F8 en un paciente con HAs sininhibidor. Para caracterizar este defecto se estudiaron las regiones 5? y el F8 IVS1 involucradas por un abordaje deanálisis de acercamiento por bipartición. Se estudiaron 6 amplímeros río-arribadel F8 (a 100, 50, 25, 12, 6 y 3kb) y3 amplímeros en el F8 IVS1 (IVS1,IVS1IU, IVS1ID) resultando todos positivos en el paciente hemicigota salvo losamplímeros de 3kb e IVS1ID. La amplificación PCR de larga distancia desde elproducto de F8-3,5kb hasta el F8-IVS1 rindió una señal específica delalelo mutado de ≈2kb cuyo análisis de restricciónmúltiple permitió diseñar primers (F8-3,5kb y F8-IVS1) para laamplificación estándar de la deleción, su caracterización y el diagnósticomolecular directo del paciente, su hermano, madre y hermana. La secuenciaciónde Sanger del producto de 362bp permitió caracterizar un rearreglo complejo de23.477bp (ChrX:154253881-154230138), notación HGSV, NM_000132.3:c.[-3056_143+12716del15914{-3056_-3057insGGTCTCG};143+12761_143+14363del1602; 143+14363_143+14425inv;143+14425_143+20543del6118{143+14425_143+14426insCCTGGCTA}]. Este rearreglo delF8 presenta tres delecionesdiscontinuas, una inversión y dos inserciones (de 7 y 8bp) en sus extremos. Los4 sitios de ruptura involucrados en la recombinación compleja presentanelementos Alu (AluY, AluS y AluJ). La complejidad estructural de este rearregloes consistente con el mecanismo FoSTeS (ForkStalling-Template Switching) pordefectos en la replicación del ADN.