ANÁLISIS DEL REORDENAMIENTO BCR/ABL1 SOBRE ADN GENÓMICO EN LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA.

LEANDRO GUTIERREZ; ABELLEYRO M; DE BRASI C; LARRIPA I

Mar del Plata

Congreso; XXII Congreso Argentino de Hematología; 2015

Soc Argentina de Hematologia

La leucemia mieloide crónica (LMC) presenta una alteración citogenética característica, el cromosoma Philadelphia (Ph1) producto de una translocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas 9 y 22 [t(9;22)(q34;q11)]. El resultado, es un gen quimérico BCR/ABL1 el cual se transcribe y traduce a una proteína oncogénica (p210bcr/abl) que posee elevada actividad tirosina kinasa (TK), la responsable de la enfermedad. En LMC, los puntos de ruptura en BCR y ABL1 están dispersos sobre intervalos de 4,5kb y 150kb respectivamente. En BCR, el 95% de las veces ocurre entre los exones 13-14 (también llamados exones b2-b3) en una región denominada M-bcr (Major breakpoint cluster region). Por otro lado, las rupturas en el gen ABL1 se distribuyen sobre los intrones 1a y 1b, lo que representa un gran desafío metodológico para las técnicas de genética molecular debido al gran área que estos intrones comprenden (aprox. 150 kb) y que convierte a cada secuencia del gen de fusión en un reordenamiento específico de cada paciente. Actualmente, el monitoreo de respuesta molecular en pacientes con LMC se basa en técnicas que evalúan el nivel de transcripción del gen quimérico (RT-PCR cualitativa o cuantitativa). Sin embargo, cuando los pacientes alcanzan respuestas moleculares completas, estas técnicas no pueden discriminar si el clon neoplásico fue erradicado, o si persiste como célula residual no proliferante.Objetivo: Diseñar una metodología que permita la detección del reordenamiento BCR/ABL1 a nivel genómico.La metodología se basa en PCR-Inversa de Larga Distancia (PCR-I-LD), sobre fragmentos de restricción específicos que contienen el gen BCR. Usando primers que tienen como blanco secuencias cercanas a los dos sitios de restricción Bcl-I que flanquean el cluster del gen BCR, establecimos el patrón de fragmentos del gen BCR de línea germinal (no rearreglado). Las variaciones en el patrón de productos de PCR-I-LD, reflejaron la presencia de segmentos del gen ABL producto de la translocación entre los cromosomas 9 y 22. Estos productos de PCR fueron entonces secuenciados y alineadas sobre un genoma de referencia pudiendo elaborar así la construcción del rearreglo BCR/ABL1 para cada paciente.Empleando esta nueva metodología basada en PCR-I-LD, fuimos capaces de caracterizar el rearreglo BCR-ABL1 a nivel genómico en cinco pacientes con LMC. Con estos datos se diseñó, una reacción PCR de tamaño estándar y caso-específica de elevada sensibilidad que nos permitió detectar la presencia del clon neoplásico en niveles donde las técnicas basadas en expresión no mostraron capacidad de detección del transcripto.El desarrollo de esta metodología nos proporcionó una nueva herramienta de alta sensibilidad aplicable para el seguimiento personalizado de cada caso, especialmente cuando los niveles del trasncripto BCR/ABL1 son indetectables.