CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA DE RNAM DE ADAMTS 13 EN PLAQUETAS POR REAL TIME.

CARRIVALE MA; KEMPFER AC; POWAZNIAK Y; SÁNCHEZ-LUCEROS A; ZAPATA VA; LAZZARI MA

Mar del Plata

Congreso; LIII REUNION CIENTIFICA ANUAL Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC)- REUNION CIENTIFICA Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS); 2008

SAIC-SAFIS

Introducción: La ADAMTS13 es una proteasa que cliva al factor von Willebrand (VWF) plasmático. En púrpura  trombocitopénica trombótica (PTT) hereditaria la actividad de ADAMTS13 está ausente o disminuida, mientras que en pacientes con PTT adquirida se ha encontrado un autoanticuerpo. El transcripto de ADAMTS13 en hígado es de 4.7Kb, mientras que en placenta se ha encontrado uno de 2.3 Kb. Susuki en 2004 reveló la presencia de mRNA en plaquetas. La cuantificación absoluta del mRNA en plaquetas informa la cantidad de ADAMTS13 que podría traducirse en condiciones normales y patológicas. Objetivo: Desarrollar un método de cuantificación absoluta del mRNA de ADAMTS 13 en plaquetas y evaluar rango en normales. Metodologías: Extracción de RNA de plaquetas, células endoteliales y tejido se realizó con TRIzol. PCR Real Time utilizando SYBR Green. La curva estándar se obtuvo por diluciones seriadas del plásmido pCMV6-XL5 ADAMTS-13, software LightCycler. Muestras: 11 normales, 1 paciente con microangiopatía trombótica (TMA) (37% de ADAMTS13 plasmática, VN 46-184%, sin mutaciones en el exón 3, 6, 20, 27, 28); 1 HUVEC, 1 HMVEC-L. Resultados: Se evaluaron los CV% en experimentos interensayos e intraensayos, fueron menores del 4% para los Cp demostrando la fiabilidad en todas las diluciones estudiadas (ANOVA, p<0.05). La sensibilidad del método fue de 3 103 copias. El rango de normales obtenido en la cuantificación del mRNA de ADAMTS13 fue 2840-58400 Nº copias, y 3-61.10-5 ng. El paciente TMA: 5310 copias y 510-5 ng. Para HUVEC y HMVEC-L: 30500 y 411000 copias, 318.10-5 y 428.10-5 ng, respectivamente. Conclusión: La actividad de ADAMTS13 en plasma del paciente estudiado se encuentra disminuida, lo que no se puede asociar a bajo nivel de transcriptos ya que este se encuentra dentro del rango normal. Por un método rápido y preciso logramos la cuantificación absoluta del mRNA de ADAMTS13 en plaquetas lo que permitirá el estudio de la relación entre la cantidad de transcriptos y proteína.