DNA-PKcs y ATM cooperan en mantener la integridad genómica frente a lesiones mediadas por ADN-topoisomerasa II en células humanas

PALMITELLI M, DE CAMPOS NEBEL, GONZÁLEZ CID M.

Buenos Aires

Congreso; XVIII CONGRESO ARGENTINO DE TOXICOLOGIA; 2013

Asociación Toxicológica Argentina

Las rupturas de doble cadena (RDC) en el ADN constituyen un daño crítico que afecta la integridad genómica. Etopósido (ETO), utilizado en tratamientos antitumorales, estabiliza los complejos ADN-topoisomerasa II (topoII) generando RDC persistentes. Esta droga, llamada veneno de topoII, convierte a la enzima en una toxina que cliva al ADN en su presencia. Nuestro trabajo evaluó el rol de las proteín-quinasas DNA-PKcs y ATM en la progresión de RDC inducidas por ETO en la fase G2 de células humanas. La línea celular deficiente en ATM (HeLa ATMkd) y la control no-silenciante (HeLa NS) se obtuvieron transfectando shRNAmir y se evaluaron por qRT-PCR. Las células se trataron con ETO 2μg/ml en presencia o no del inhibidor químico de DNA-PKcs, NU7026 (10μM), se expusieron a citocalasina B (3μg/ml) durante las últimas 4hs de cultivo y se evaluaron los micronúcleos (MN) y las RDC en MN y núcleos principales de células binucleadas (BN) a las 10hs postratamiento (daño G1-posmitótico) mediante inmunomarcación. En HeLa NS, el porcentaje de células BNMN se incrementó con ETO y NU7026-ETO. En HeLa ATMkd este porcentaje fue similar en los dos tratamientos. En ambas líneas, la fracción de MN con focos γH2AX (marcador de RDC) aumentó con ETO (~15%). En presencia de NU7026, ese valor fue mayor en HeLa NS que en ATMkd. Al analizar focos γH2AX en los núcleos principales se observó que 40%±5,6 y 16,4%±2,1 de las células BN HeLa NS y ATMkd tratadas con NU7026-ETO, respectivamente, repararon las RDC inducidas (sin focos γH2AX). Este tratamiento combinado aumentó 2,2 veces el porcentaje de células con >20 focos γH2AX en HeLa ATMkd respecto al hallado en HeLa NS. El porcentaje de células BN (índice de citotoxicidad) en HeLa NS con ETO fue 9,4%±0,7 y se redujo a 7,0%±0,02 con NU7026-ETO. En células ATMkd, ambos tratamientos no modificaron el porcentaje de células BN (8,5%). Los resultados sugieren que la falta de DNA-PKcs y ATM contribuye, en forma aditiva, a la progresión de células dañadas.