Mantenimiento de la integridad cromosómica frente al daño inducido por el veneno de topoisomerasa II Etopósido en células humanas

PALMITELLI M; DE CAMPOS NEBEL M; GONZALEZ CID M

Revista de la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales

Universidad de Morón

Año: 2014 vol. 12 p. 21 - 40

0328-6312

La enzima Topoisomerasa II (Topo II) desempeña múltiples funciones en procesos celulares como replicación, transcripción, recombinación y condensación cromosómica. Bajo condiciones fisiológicas, Topo II actúa catalizando la liberación de torsiones sobre el ADN a través de la introducción de rupturas transitorias en la doble cadena del mismo. Muchas drogas quimioterapéuticas, como Etopósido (ETO), actúan como venenos de Topo II en células humanas. Estos venenos estabilizan los complejos ADN-Topo II, previniendo la religación de los extremos rotos y originando rupturas de doble cadena (RDC) persistentes. Las RDC en el ADN son lesiones que afectan la estabilidad del genoma. En mamíferos, las RDC son reparadas principalmente por dos mecanismos: recombinación homóloga (?homologous recombination?, HR) y reunión de extremos no homólogos (?nonhomologous end joining?, NHEJ). La diferencia principal entre ambas vías reside en que NHEJ actúa en forma rápida aunque está sujeta a cometer errores y HR lo hace en forma lenta pero es una vía segura. Esta diferencia se basa en que NHEJ junta y une extremos de moléculas de ADN produciendo ganancia y/o pérdida de unos pocos nucleótidos alrededor de la lesión, mientras que HR utiliza una molécula de ADN homóloga no dañada, para restaurar la información original. En NHEJ participa DNA-PKcs (subunidad catalítica de la proteína quinasa relacionada al ADN), por lo que se definió a esta vía dependiente de DNA-PKcs, D-NHEJ. Cuando DNA-PKcs está inhibida químicamente, las células utilizan una vía alternativa que opera como ?backup? de NHEJ, denominada B-NHEJ. Se ha reportado que la actividad de D-NHEJ, y no de HR, en células de hámster chino tratadas en la fase G2 es importante para promover la progresión de células con daño cromosómico al siguiente ciclo celular. En base a estos resultados, el presente trabajo profundizó el análisis del daño al ADN inducido por ETO en células humanas tratadas en G2 y los factores que posibilitarían la progresión de ese daño. Para ello se evaluó la inducción de RDC por ETO mediante la fosforilación de la histona H2AX (γH2AX) en células de la línea humana tumoral HeLa en la fase G2 del ciclo celular. ETO indujo la formación de más de 60 focos γH2AX por núcleo en el 80% de las células. Las RDC pueden convertirse en aberraciones cromosómicas (AC) estructurales por falta y/o incorrecta reparación de las mismas. Las células HeLa, tratadas con ETO en la fase G2 presentaron rupturas e intercambios cromatídicos en la metafase siguiente al tratamiento. Para evidenciar la participación de la vía D-NHEJ en la generación de AC inducidas por ETO, las células se pretrataron con el inhibidor de DNA-PKcs (NU7026). La inhibición de D-NHEJ duplicó el porcentaje de aberraciones de tipo cromatídico en la metafase siguiente al tratamiento, en relación a las inducidas por ETO solo. Además, produjo una importante citotoxicidad disminuyendo el número de células posibles de ser analizadas. Asimismo se evaluó la participación de la vía HR en la reparación de RDC mediante el análisis de intercambio de cromátidas hermanas (ICH) inducido por ETO solo o combinado con NU7026 en la fase G2. De las lesiones inducidas por ETO, una fracción fue reparada mediante HR y esto se reflejó en un aumento en el número de ICH por cromosoma respecto a sus controles. En cambio, en presencia de NU7026, un porcentaje menor de lesiones fue reparado por esta vía, acompañado de una importante reducción de la viabilidad celular. Por otro lado, se evaluó la progresión de células con AC inducidas por ETO mediante el análisis de micronúcleos (MN) en células BN. Además se estudió la inducción de RDC mediante la presencia de focos γH2AX en los MN y en los núcleos principales de células BN. Los resultados indicaron que el tratamiento con ETO incrementó el porcentaje de células BN con MN, MN con focos γH2AX y células BN con focos γH2AX en los núcleos principales. Este efecto se potenció por la inhibición química de D-NHEJ en comparación con ETO solo. Se puede concluir que en las células humanas HeLa, las RDC inducidas por ETO en la fase G2 se reparan principalmente por la vía D-NHEJ. La inhibición química de DNA-PKcs retarda la respuesta reparadora e induce que las RDC sean reparadas por la vía B-NHEJ, lo que genera un aumento de las aberraciones cromatídicas y una disminución de la viabilidad celular luego del tratamiento con ETO. Además una fracción de las RDC es reparada por HR, como se evidenció por el aumento del ICH. En comparación con B-NHEJ, la vía D-NHEJ mantiene la integridad cromosómica y permite que las células con daño en el ADN progresen al siguiente ciclo.