Informe Técnico Final PICT 2007-939

NOVARO, VIRGINIA

2009-06-05/2012-06-05

Biológica

Salud humana

a) Resultados publicados en el artículo PlosONE (Polo et al. 2010): Demostramos que la vía de PI3K/AKT es fundamental para la regulación de la expresión de receptores hormonales de estrógenos (ER) y progesterona (PR), y  para el crecimiento de tumores mamarios independientemente del agregado de medroxiprogesterona (MPA), llamados tumores C4-HI. El crecimiento de esos tumores es bloqueado con LY294002, un inhibidor de PI3K/AKT. Sin embargo, la variante tumoral que requiere el MPA para crecer, C4-HD, se bloquea significativamente con agentes endócrinos ICI182780 y ZK230211, pero no requiere de la activación de la vía de PI3K/AKT. Los resultados obtenidos indican además que la activación diferencial de PI3K/AKT es dependiente del contexto celular, ya que en cultivos celulares en plástico donde no se mantienen las interacciones célula-célula se pierden las diferencias entre las variantes tumorales C4-HD y C4-HI observadas in vivo. Estos resultados, nos indican que la activación de la vía de AKT, a partir de señales parácrinas del tejido tumoral, puede modificar el comportamiento y respuesta hormonal de los tumores mamarios. Utilizando el cultivo en Matrigel observamos la participación de PI3K/Akt en la organización tisular y en la polarización de estructuras celulares diferencialmente en los cultivos derivados de tumores C4-HI. Este fenotipo in vitro refleja una característica in vivo relevante del tumor C4-HI, el cuál es más diferenciado que el tumor C4-HD y presenta estructuras con organización típica ductal. De esta manera, el uso de cultivos tridimensionales que preservan las características diferenciales de los tumores mamarios es útil para testear los efectos de inhibidores selectivos en el crecimiento del tumor y resaltan la necesidad de tener modelos experimentales como herramienta para validar el uso de targets terapéuticos específicos. b) Resultados publicados en el artículo Carcinogenesis (Riggio et al. 2011): Para evaluar si la activación de la vía de PI3K/AKT es causa del crecimiento tumoral hormono-independiente (HI), infectamos células provenientes de cultivos hormono-dependiente (HD) con una construcción que contiene una forma constitutivamente activada de AKT1 (myrAKT1), o con el plásmido vacío como control. Al inocular estas células en ratones nude se generaron tumores aún en ausencia de MPA. Estos tumores presentaron una histología diferenciada, típica de los tumores HI con un aumento en la expresión de citoqueratina 8 y laminina-1. Además, al analizar los receptores hormonales, observamos que los tumores C4-HD-myrAKT1 presentaron mayor activación del ER y PR. Estos resultados indican que la vía de PI3K/AKT causa la transición hacia la HI, ya sea activando directamente proteínas involucradas en el crecimiento celular, o indirectamente, vía activación MPA-independiente de receptores hormonales. Para evaluar si este efecto es específico de nuestro modelo, o se puede extrapolar a otros modelos, utilizamos las líneas celulares de cáncer de mama humanas IBH-6 (de comportamiento HI in vivo) e IBH-7 (HD in vivo), a las que transfectamos con myrAKT1, o con el plásmido vacío como control. En las células IBH-6-myrAKT1, observamos un aumento en la expresión y activación de ER y PR. Este resultado sugiere que la activación de vías de señalización, como PI3K/AKT, produce una inducción ligando-independiente de los receptores hormonales que acompaña la progresión tumoral. Además observamos que las células IBH-6-myrAKT1 generaron un mayor número de mamoesferas, y de mayor tamaño que las células control. Este resultado sugiere que las células que poseen la vía de AKT1 sobreactivada podrían estar enriquecidas en una población troncal, responsable del mayor crecimiento tumoral observado in vivo. La línea IBH-7, que al ser inoculada en ratones sólo crece en presencia de estradiol (E2), fue transfectada establemente con myrAKT1 o el plásmido control. Al inocular dichas células en los animales, en presencia de E2, las células control y myrAKT1 crecen indistintamente, sin embargo en ausencia de E2 sólo las IBH-7-myrAKT1 fueron capaces de originar tumores. Las células myrAKT1 mostraron además activación ligando-independiente de los receptores hormonales ER y PR. Por último, cultivos in vitro de células IBH-7-myrAKT1 presentaron  un cambio morfológico respecto a las células control, mostrando un fenotipo más redondeado, acompañado de un aumento en la expresión de proteínas de adhesión como FAK, E-cadherina y falloidina. Con estos resultados podemos corroborar lo antes observado en el modelo animal, y extrapolar el efecto de la activación de AKT1 y su relación con la hormono-independencia tumoral y el cambio morfológico hacia otros modelos, siendo así un resultado más relevante para la clínica. c) Resultados aún no publicados (serán publicados en los próximos meses luego de terminar experimentos clave) Nuestros resultados muestran que la vía PI3K/AKT sería un target terapéutico clave en el surgimiento de tumores mamarios autónomos que tienen la posibilidad de desarrollar posteriormente resistencia endócrina. Por lo tanto, nuestro siguiente objetivo es entender los procesos celulares responsables de causar tales cambios fenotípicos para poder desarrollar estrategias terapéuticas más efectivas y prevenir el surgimiento de variantes tumorales resistentes a las terapias convencionales que pierden el fenotipo diferenciado y son más agresivas. Én el último año hemos logrado el silenciamiento específico de las isoformas Akt1 y Akt2 en células tumorales mamarias sensibles y resistentes al RU486y serán utilizados para dilucidar su participación en el fenotipo tumoral. Los resultados obtenidos en modelos tumorales de regresión temprana muestran que: La variante C4-HD regresiona preferentemente con agentes endócrinos: RU486 (12mg/kg/día); ICI182780 (25 mg/kg); Citrato de Tamoxifeno (5mg/kg/día). La regresión de dichos tumores ocurre por un mecanismo semejante a la cicatrización tisular, con gran invasión de estroma activado. La variante C4-HI regresiona preferentemente con inhibidores de PI3K como LY294002 o Wortmannin (1mg/kg/día). El mecanismo de regresión de la variante HI es por reorganización tisular que genera un tejido más diferenciado y ductal. Entonces, las variantes tumorales estudiadas presentan su propio mecanismo de regresión determinado por características propias de las células tumorales (epiteliales y estromales) y de la relación establecida entre ellas. Además, en los tumores C4-HI el tratamiento conjunto con RU486 y Wortmanin provocó un efecto aditivo de regresión tumoral. Cuando evaluamos en una variante tumoral resistente al RU486 denominada C4-2-HI, la efectividad de la terapia de inhibición de la vía PI3K/AKT con Wortmannin observamos que tanto in vivo como in vitro se produce un retraso en el crecimiento tumoral en presencia de Wortmannin.Mediante la evaluación histológica de los tumores, comprobamos que la inhibición de la vía PI3K/AKT no provoco una disminución en el índice mitótico, y tampoco se observaron aumentos en el índice apoptótico o en el área necrótica tumoral.  Sin embargo, pudimos detectar una disminución en el número de vasos sanguíneos y capilares en el tejido tumoral con respecto a los grupos control y RU486. Asimismo,  en comparación con dichos grupos, los tumores tratados con Wortmannin solo o en combinación con RU486,  presentaron grandes áreas tumorales de células con cromatina compactada, que evidencia que no se encuentran en una activa división celular. Actualmente, continuamos estudiando las tres variantes descriptas en el modelo murino ya que representan tipologías particulares en el cáncer de mama humano y resultan un modelo interesante para vincular  a la vía PI3K/AKT en  la progresión y en la regresión tumoral. Nuestro objetivo a futuro es poder diseñar terapias antitumorales específicas y selectivas para cada tipo de tumor, según los mecanismos celulares involucrados en la arquitectura típica de cada variante.