Evaluacion funcional y estructural de un fragmento de anticuerpo como potencia terapia contra las Fiebres Hemorrágicas Sudamericanas

HELGUERA G.; DANIELS-WELLS T.; ARAGÜES, R.; PAYÉS, C.; RODRÍGUEZ J. A.; CASCIO, DUILIO; ZIEGENBEIN, J.; PENICHET M. L.; SAWAYA, MICHAEL R.; DIEP, A.

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Las Fiebres Hemorrágicas Sudamericanas (FHS) son graves enfermedades consideradas Categoría A por el National Institute of Allergy and Infectious Diseases debido a su infectividad y mortalidad. Los agentes etiológicos de estas enfermedades son los arenavirus Chapare (CHAV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV), Sabiá (SABV) y Junín (JUNV). Existe tratamiento sólo para este último, causante de la Fiebre Hemorrágica Argentina. Este consiste en la inmunoterapia pasiva con plasma de pacientes convalecientes, pero su calidad es variable con riesgo de enfermedades por transfusión. Por esto y en ausencia de tratamiento contra las otras FHS, son necesarias nuevas terapias. La entrada de estos arenavirus a las células humanas ocurre vía endocitosis mediante la unión de la glicoproteína (GP1) viral con el receptor de transferrina 1 humano (hTfR1). Hemos demostrado que el anticuerpo monoclonal (AcM) quimérico ch128.1 se une al dominio apical del hTfR1 e inhibe la internalización de JUNV, MACV, GTOV, SABV y CHAV. Sin embargo, ch128.1 tiene isotipo humano IgG3 o IgG1, presentando riesgos de inducir una reacción inflamatoria en tejidos sanos. El objetivo de este trabajo es avanzar en el desarrollo de un nuevo AcM contra las FHS que no induzca actividad inflamatoria. Por lo tanto se evalúa la interacción de hTfR1 con un fragmento de AcM con la región variable de ch128.1 (Fab128.1), su habilidad para bloquear la entrada de los arenavirus causantes de FHS y se analiza la estructura cristalográfica del fragmento.El Fab128.1 se obtuvo como fragmento del AcM ch128.1 con región constante humana IgG1-kappa digerido con papaína. El dominio extracelular recombinante de hTfR1 (sTfR1) se expresó en células humanas HEK-293. La determinación de la unión del Fab128.1 a sTfR1 se evaluó por ELISA sandwich y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La inhibición de internalización de virus de FHS se estudió con pseudovirus de JUNV y MACV decorados con sus GP1/GP2 que expresan eGFP. Los pseudovirus se incubaron en presencia de Fab128.1 y el porcentaje de inhibición de internalización en células HEK-293T se midió por citometría de flujo. El análisis estructural del Fab128.1 se realizó cristalizando por difusión de vapor en gota colgante y los cristales se sometieron a difracción de rayos-X de alta resolución en el APS (Laboratorio Nacional Argonne; EEUU). La estructura se resolvió por reemplazo molecular.Se pudo determinar que al igual que el AcM ch128.1, el Fab128.1 se une a sTfR1 y es capaz de bloquear la internalización de pseudovirus de JUNV y MACV. También, se lograron obtener cristales de Fab128.1 y se resolvió su estructura atómica con una resolución de 2.9Å. Estos estudios confirman que el fragmento de AcM monovalente Fab128.1 puede bloquear la entrada de arenavirus de FHS in vitro como el AcM completo, y contribuyen al diseño racional de un biofármaco que pueda ser producido a bajo costo en bacterias, y que constituya una terapia eficaz y segura contra las FHS.