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El desarrollo y optimización de energías alternativas que sean limpias y renovables es un área de gran interés a la hora de pensar en el cuidado del medio ambiente. En este contexto, la fermentación con cultivos mixtos utilizando carbohidratos como sustrato, permite producir hidrógeno biológico a partir de microorganismos provenientes de aguas cloacales. Este gas tiene una alta densidad energética y puede ser utilizado como vector de energía limpia en celdas de combustible PEM, produciendo agua como único residuo. En este trabajo evaluamos el efecto en los rendimientos y porcentajes de hidrógeno obtenidos en frascos Erlenmeyer, al aplicar un pretratamiento con calor de los inóculos. Esto nos permite seleccionar los microorganismos productores de hidrógeno que son capaces de formar esporas, eliminando microorganismos indeseados que lo utilizan como sustrato. La utilización del pretratamiento permitió obtener porcentajes de hidrógeno mayores y, a tiempos largos de cultivo, rendimientos algo superiores.Por otro lado, evaluamos el efecto de distintas soluciones amortiguadoras para regular el pH del medio. Se realizaron cultivos con el buffer comercial MES (de pKa 6,15) y con un buffer acéticoacetato de preparación propia, a pH 5,2. La caída abrupta del pH por debajo del rango de regulación al utilizar buffer MES se debe a que ésta solución es incapaz de actuar como amortiguador, mientras que el buffer acético-acetato mantiene el pH en valores cercanos al pKa del ácido acético, que es uno de los principales productos de fermentación. Este nuevo buffer, al ser más económico, se utilizó para realizar un escalado en un biorreactor de 5 litros, almacenando el gas producido en un sistema de tubos, a presión cercana a la atmosférica. De esta manera, al trabajar con una presión parcial de hidrógeno menor que en frascos, logramos obtener mejores rendimientos que los reportados en bibliografía para cultivos mixtos.