IBYME   02675
INSTITUTO DE BIOLOGIA Y MEDICINA EXPERIMENTAL
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
ESTUDIO A ESCALA GENÓMICA DE LA RESPUESTA TIPO CELULAR ESPECÍFICA EN CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA DE ENDOMETRIO ISHIKAWA Y CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA T47D
Autor/es:
LA GRECA, ALEJANDRO; SORONELLAS, DANIEL; VALLEJO, GRISELDA; MERINO, GABRIELA; FRESNO, CRISTOBAL; VICENT, GUILLERMO; FERNANDEZ, ELMER; BEATO, MIGUEL; SARAGÜETA, PATRICIA
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; LVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC); 2013
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC)
Resumen:
Estudio a escala genómica de la respuesta tipo celular específica en células de adenocarcinoma de endometrio Ishikawa y células de cáncer de mama T47D La Greca A1, Soronellas D2, Vallejo G1 , Merino G3 , Vicent G2, Fresno C3, Fernández E3, Beato M2, Saragüeta P1. 1-Instituto de Biología y Medicina Experimental, IBYME-CONICET, Buenos Aires, Argentina 2-Centro de Regulación Genómica, CRG, Barcelona, España 3-Centro de Explotación de datos y biociencias, Universidad Católica de Córdoba, Córdoba, Argentina Palabras clave: endometrio, Ishikawa, progesterona, receptor de progesterona, genoma. La progesterona (Pg) es un modulador clave de las funciones del tracto reproductivo femenino, incluyendo el desarrollo del útero y de la glándula mamaria. Los estudios en ratones knock-out (KO) de las isoformas A o B del receptor de progesterona (RPA o RPB), del coactivador del receptor de esteroides (SRC) 1 o del SRC-3 evidenciaron efectos diferenciales tejido específicos en la glándula mamaria y en el útero (Mulac-Jericevic y col., 2004; Han y col., 2006). En este trabajo nos proponemos caracterizar los mecanismos tipo celular específicos inducidos por la activación de cascadas de señalización citoplasmáticas y la regulación génica dependientes de progestinas en la línea celular de adenocarcinoma de epitelio endometrial humano Ishikawa. En particular, utilizamos la línea de cáncer de mama T47D como modelo comparativo para el análisis de los fenómenos específicos de tejido. Estudiamos los efectos del tratamiento con la progestina R5020 (R5020), análogo sintético de la progesterona, y el estradiol (E2) sobre la activación de quinasas y la expresión génica dependientes del receptor de progesterona (RP) en la línea celular Ishikawa. Evaluamos la fosforilación de ERK 1/2 y de AKT en respuesta a 5 y 10 minutos (min) de tratamiento con R5020 10nM mediante western blot y observamos que la activación de ERK aumenta a los 5 min y disminuye a los 10 min. La máxima activación de ERK es inhibida por RU486 (antagonista de RP) y por ICI182780 (antagonista del receptor de estrógenos, RE); sugiriendo que los receptores, RP y RE, están involucrados en la activación rápida y transitoria de esta quinasa (La Greca y col., 2010). La inhibición en el aumento de los niveles de fosforilación de ERK en presencia de ICI182780 implica no solo la participación de RE en este mecanismo, sino también que dicho receptor participa independientemente de su unión al ligando como ya se había demostrado en otros tipos celulares (Ballaré y col., 2003, Vallejo y col, 2005). Por otro lado, AKT no mostró variación en su nivel de fosforilación bajo estas condiciones (La Greca y col., 2010). Las células de cáncer de mama T47D presentaron un patrón temporal diferente, siendo el aumento máximo en la fosforilación de ERK a los 10 min y el de AKT desde los 5 min. Ambos efectos fueron inhibidos por los antagonistas de los receptores RE y RP (Ballaré y col., 2006). Analizamos el estado de fosforilación del RP luego del tratamiento con la progestina, particularmente en los residuos S294 y S400 que constituyen marcadores de la activación del receptor (Knotts y col., 2001). Realizamos inmunofluorescencias con un anticuerpo específico para RP fosforilado en S294 y encontramos que luego de 5 min de tratamiento con R5020 10 nM incrementa la localización nuclear del receptor de 19% (tiempo cero) a 32% (5 min) y continúa aumentando hasta alcanzar el 57% a los 30 min. No detectamos la fosforilación en la S400 del RP en ninguno de los tiempos de tratamiento. Si bien este aumento en la fosforilación de S294 del RP indicaría que el receptor sería capaz de pegarse al DNA y transactivar, no descartamos que la ausencia de fosforilación en S400 sea importante para la funcionalidad óptima del RP como factor de transcripción. Evaluamos la capacidad del RP endógeno de transactivar un gen reportero (luciferasa) cuya zona regulatoria contiene múltiples y probados sitios de unión de RP (Vicent y col., 2006). El nivel de actividad de luciferasa aumentó significativamente en células Ishikawa co-transfectadas transitoriamente con los vectores MMTV-Luc y CMV-renilla (Proietti y col., 2011) tratadas con R5020 10 nM durante 20hs, sugiriendo que el receptor se reclutaría a los elementos respuesta en el promotor exógeno. Estos resultados indican que el RP presente en las células endometriales Ishikawa se activa y trasloca al núcleo de manera progestina-dependiente, y que actuaría como factor de transcripción en estas condiciones en estas células. Investigamos la capacidad del RP de posicionarse sobre secuencias blanco en el genoma de células Ishikawa mediante la técnica de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Estudiamos el reclutamiento del receptor en respuesta a tratamientos cortos (5, 30 y 60 min) con R5020 10 nM en zonas regulatorias previamente caracterizadas en la línea celular de cáncer de mama T47D (Ballaré y col., 2013), entre ellas una secuencia asociada a la regulación hormono-dependiente del gen epidermal growth factor receptor (egfr) presenta el máximo reclutamiento del receptor sobre esta secuencia a los 60 min de tratamiento con R5020. Teniendo en cuenta los resultados descriptos, nos propusimos realizar ensayos a escala genómica del reclutamiento del RP a sus genes blanco mediante la tecnología ChIP seguida de secuenciación masiva (ChIP-seq) en células Ishikawa sin tratar y tratadas por 5, 30 y 60 min con R5020 10 nM (Fig. 1 y 2). Los primeros resultados indican que en las células Ishikawa el RP se recluta en 65 sitios aproximadamente y la mayoría de estos sitios se observan a los 30 min (55) y a los 60 min (53) (Fig. 1A y 1B). En las células T47D fueron descriptos numerosos sitios, 25876 a los 30 min y 24436 a los 60 min (Ballaré y col., 2013). Análisis bioinformáticos preliminares indican que la mayoría de los sitios de unión del RP (32,4%) en células Ishikawa no tratadas con la progestina (T0) se localizan a menos de 1 kilobase (500bp desde SIT). El alto del pico equivale al número de lecturas (reads). Flechas horizontales negras simbolizan la extensión y orientación del gen; flechas celestes marcan la posición de los sitios enriquecidos en RP. Fig. 4. R5020 y E2 inducen la expresión de alpp en forma aditiva mientras que R5020 inhibe la expresión estrógeno-dependiente de pgr. Células Ishikawa fueron tratadas o no (T0) por 12 hs con vehículo (OH), R5020 10 nM (R), estradiol 10 nM (E) y R5020 10 nM y estradiol 10 nM (RE). Se colectó el ARN total y se llevaron a cabo PCR en tiempo real usando primers específicos para A) id3 B) alpp y C) pgr. ***P