Activación de vías de señalizacion por Ror1 en melanoma.

LORENZO D; FERNANDEZ N; BRAVO MS; LOPEZ BERGAMI, P

Buenos Aires

Jornada; XXVIII Jornadas de Oncologia; 2012

Instituto Roffo

ROR1 activa la vía de señalización de Wnt no canónica en melanoma.Lorenzo D., Fernández N., Picco M.E., López Bergami P.Instituto de Biología y Medicina Experimental-CONICET, Buenos Aires, Argentina.Introducción: El melanoma representa un importante problema sanitario debido a su malpronóstico y a la falta de terapias efectivas en el estadio metastático de la enfermedad.Esto se debe, en parte, a que las células de melanoma poseen múltiples vías deseñalización constitutivamente activas entre las cuales se encuentran la vía MAPK, PI3K/Akt, MITF, PKC, NFkB y p16INK4A. Se ha demostrado que las vías de señalización deWnt canónico y no canónico también se encuentran activadas y que la sobreexpresión deWnt5A esta implicada en melanoma metastático.Objetivo: Caracterizar molecularmente la vía de señalización Wnt no canónico y su posibleinteracción con otras señales activas en melanoma. Esta información será de utilidad parainterpretar fenómenos de resistencia a tratamientos con distintos compuestos.Materiales y Métodos: Utilizando ADNc de melanocitos normales y de líneas celulares demelanoma se determinó los niveles de ARNm de los receptores Fzd y ROR (Fzd3, Fzd5,Fzd6, Fzd7, ROR1y ROR2) mediante la técnica de Real time PCR normalizando los valoresobtenidos a la expresión de RNA polimerasa II. Se generaron células que expresan enforma estable el shRNA para ROR1 mediante infección viral. Se realizaron ensayos dewestern blot para estudiar los niveles proteicos de las proteínas involucradas en la vía deseñalización de Wnt (ROR1, Dvl-2, PKC, Rho y Rac). Para determinar la activación delas pequeñas GTPasas Rho y Rac se realizó ensayos de “pull-down”. Para los ensayosreporteros se tranfectó el plásmido reportero TOP/FOP empleando lipofectamina.Resultados: Se observó un marcado incremento en los niveles de ARNm de ROR1 yFzd7 en las líneas de melanoma con respecto a los melanocitos control. Los altos nivelesde ROR1 fueron confirmados por western blot. En concordancia con la sobreexpresiónde Wnt5a y ROR1 en melanoma, observamos que la proteina Dvl-2 se encuentraconstitutivamente fosforilada en varias líneas de melanoma. Para demostrar la contribuciónde ROR1 en la fosforilación de Dvl-2 utilizamos células que expresan establemente unshort hairpin ARN (shARN) contra ROR1 (Lu1205 y A375). El silenciamiento de ROR1redujo los niveles basales de fosforilación de Dvl-2. Con el fin de identificar mediadoresrío abajo en la vía de ROR1 y Dvl2 determinamos la activación de pequeñas GTPasas. Elsilenciamiento de ROR1 en células Lu1205 y A375 redujo los niveles de GTP unido a RhoA/C indicando una disminución en los niveles de actividad GTPasa. Además, estudiamoslos niveles proteicos de diversas isoformas de la proteína kinasa C (PKC). Encontramosque el silenciamiento de ROR1 produce aumentos en los niveles de PKC alfa y disminuciónen los niveles de PKC beta en las líneas celulares Lu1205 y A375. También encontramosun aumento en los niveles de PKC epsilon en las células Lu1205 y una disminución en losniveles de PKC delta en las células A375. Asimismo, mediante la realización de ensayosreporteros determinamos que ROR1 no esta vinculado a la via canónica de Wnt ya que susilenciamiento no afecta la activación del reportero TOP en respuesta a Wnt3a.Conclusión: Nuestros resultados muestran que ROR1 esta sobreexpresado en melanomay contribuye a la activación de la vía de señalización Wnt no canónica a través de laactivación de Dvl-2, RhoA/C y PKC. Estas evidencias sugieren que ROR1 podría estarimplicado en el desarrollo y la progresión del melanoma.