Análisis de técnicas moleculares que sirvan como herramientas para identificar pacientes con cáncer de mama con una alta expresión de la isoforma A del receptor de progesterona (RP-A).

SEQUEIRA G; CASTILLO L. F; MAY M; GASS H; GONZALEZ P; MARTINEZ VAZQUEZ P; LANARI C; ROJAS P.

Mar del Plata

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2011

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Introducción Los Receptores de Progesterona (RP) son factores de transcripción que han sido implicados en una amplia variedad de procesos biológicos incluyendo el desarrollo de la glándula mamaria. Existen dos isoformas del RP, RP-A y RP-B, que derivan de promotores alternativos (promotor distal: promotor RP-B, promotor proximal: RP-A) de un mismo gen localizado en el cromosoma 11 q22-q23 humano (cita). Los dos receptores, RP-A y RP-B, son idénticos excepto que el RP-B tiene 164 aminoácidos adicionales en el segmento N-terminal (BUS), que contiene una función activadora. Las dos isoformas coexpresan en los tejidos, pero está ampliamente demostrado in vivo que poseen diferentes funciones En cáncer de mama el 75% de los pacientes presenta receptores hormonales de estrógeno (RE) y progesterona (RP) haciéndolos candidatos para una terapia hormonal. La mayoría de las terapias hormonales aplicadas en la actualidad están dirigidas al RE. Ejemplos son el tamoxifeno un SERM que regula al RE como el raloxifeno, también existen los inhibidores de aromatasa (IA) que inhiben la síntesis de estrógenos como el anastrozol o un inhibidor puro como el fulvestrant. Debido a que existe evidencia de que la progesterona participa en el desarrollo y progresión de los tumores y que el RP es regulado por estrógenos es razonable pensar en una estrategia terapéutica dirigida al RP. Los estudios preclínicos realizados con RP muestran que en ratones que desarrollan tumores de mama que expresan altos niveles RP y RE el tratamiento con antiprogestágenos produce regresión tumoral solo en los tumores que expresan mayor proporción de RP-A que de RP-B. Estudios en cultivos primarios de cáncer de mama humano tratados con RU-486 (10nM) mostraron resultados similares en los tumores que expresaban mayor proporción RP-A/RP-B. Mas aún como el grupo de S. Fuqua mostró que aquellos tumores con altos niveles de expresión de RP-A son aquellos que responden menos a la terapia con TAM 45 Debido a que la evidencia bibliográfica muestra como blanco factible al RP y que los estudios preclínicos muestran que no solo el RP es importante como blanco si no que la mayor expresión de la isoforma A es la que determinaria la respuesta tumoral a los antiprogestágenos nosotros creemos que existe un grupo de pacientes que se beneficiarian de la terapia con antiprogestágenos si son correctamente identificados El método clásico empleado en patología para determinar el estatus de RP, no discrimina entre ambas isoformas. Una de las técnicas a emplear que nos permite determinar la relación de ambas isoformas es el Western Blot (WB). Hipótesis En este trabajo nos proponemos determinar si el ARNm nos podría brindar la misma información sobre la proporción de isoformas del RP (RP-A/RP-B) que el western blot (WB) en muestras de biopsias. Sería de gran utilidad poder utilizar para la determinación de las isoformas la técnica que sea mas efectiva y a que a la vez nos permita trabajar con la menor cantidad de material posible. Objetivo: En muestras de biopsias de pacientes con cáncer de mama: -Evaluar por WB y por RT-PCR (qPCR) la expresión proteica y de ARN mensajero de las isoformas del RP. Cuantificar los datos obtenidos en el WB para cada isoforma y establecer la relación PR-A/PR-B. Correlacionar estos valores con los obtenidos por qPCR. Materiales y Métodos Muestras de tumores humanos: Se utilizaron 50 muestras de pacientes RP positivos provenientes del Hospital Magdalena V de Martínez, Gral. Pacheco. Todos los pacientes firmaron previamente un consentimiento informado para participar del estudio. Western Blot: Las muestras de tumor preservadas a -80ºC se procesaron para obtener los extractos de proteínas nucleares y citoplasmáticos (nombre kit). Se corrieron 100 μg de cada extracto en un gel de poliacrilamida al 8% y luego se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Se bloqueó ON con el anticuerpo primario PgR 1294 (DAKO) y luego con anti-mouse conjugado a peroxidasa (Amersham Life Science). La intensidad de las bandas obtenidas para las isoformas del RP se cuantificó usando el software Image Quant. PCR cuantitativa (qPCR): El ARN total de las muestras tumorales se extrajo con TRIZOL REAGENT (Invitrogen) según protocolo del proveedor. La transcripción reversa se realizó con el kit Super Script III First-Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen) según protocolo del proveedor. Se utilizó 1 μg de ARN total por cada muestra. El ADNc obtenido se usó como templado para la qPCR realizada con el kit Sybr Green Supermix (Applied Biosystems). El Termociclador utilizado fue ?..(Applied Biosystems). Los primers utilizados para la amplificación del RP que se detallan a continuación fueron diseñados utilizando el programa Primer-BLAST (NCBI) Análisis estadístico Los resultados obtenidos por WB y qPCR se analizaron? Resultados: Debido a que ambas isoformas están incluidas en el mismo gen desarrollamos primers específicos que identifican a ambas isoformas o sólo a RP-B. Seleccionamos 50 muestras de tumores de pacientes RP+ obtenidas del Hospital Magdalena V de Martinez, Gral. Pacheco, que firmaron previamente un consentimiento informado. Para empezar con el análisis, evaluamos muestras que reflejaran grupos con una alta (> 1.2), media (< 1,2 a 0.8) y baja (< 0,8) relación RP-A/RP-B obtenidas por WB. Hasta el momento se estudiaron 22 muestras mostrando que no existe correlación entre la expresión proteica de las isoformas del RP y la expresión génica determinada por RT-PCR (p