Nuevas evidencias acerca del proceso de descondensacion del espermatozoide in vivo

JULIANELLI VL; FARRANDO B; RAFFO F; CALVO JC; CALVO L; ROMANATO M

Panamá

Congreso; XXII Reunión Bienal de la Asociación Latinoamericana de Investigadores en Reproducción Humana (ALIRH); 2011

Asociación Latinoamericana de Investigadores en Reproducción Humana (ALIRH)

La descondensación del núcleo espermático humano in vivo, ocurriría en presencia de glutatión y heparán sulfato (HS). La presencia de glutatión en el ooplasma ha sido ampliamente demostrada por otros grupos, y hasta el momento, sólo hemos demostrado presencia de HS en ovocitos maduros e inmaduros murinos. La descondensación cromatínica involucra dos fenómenos: tiorreducción de las protaminas espermáticas y su reemplazo por histonas ovocitarias. Se ha propuesto que estos procesos ocurren en forma sucesiva e independiente. Sin embargo, nuestros resultados previos utilizando Naranja de Acridina (método indirecto), sugieren que heparina, análogo del HS, coopera con glutatión en la tiorreducción de protaminas durante la descondensación espermática humana in vitro. Objetivos 1) Evaluar presencia de HS en ovocitos inmaduros humanos y células del cúmulus. 2) Analizar efecto de heparina sobre tiorreducción cromatínica durante la descondensación espermática humana in vitro utilizando método directo. Metodología 1) Evaluamos presencia de HS por inmunocitoquímica en ovocitos inmaduros humanos y células del cúmulus provenientes de pacientes que acudieron a clínica de fertilidad con previa firma de consentimiento informado. Quitamos zona pelúcida de ovocitos, fijamos, permeabilizamos y realizamos inmunocitoquímica en ambos tipos celulares utilizando anti-HS monoclonal y anti-IgM-FITC de ratón. Marcamos ADN con ioduro de propidio. 2) Núcleos espermáticos (donantes OMS) se incubaron con tiorreductor: 10 mM glutatión o 0,1mM DTT, 30 minutos, con o sin heparina (46 µM) durante 5 minutos finales. Se evaluó estado tiorreducido por tinción con reactivo tiólico monobromobimane, cuantificando fluorescencia por Image J. Resultados y conclusiones 1) Observamos presencia HS con localización citoplasmática homogénea y nuclear en ambos tipos celulares. 2) La exposición a los tiorreductores aumentó intensidad de fluorescencia en núcleos espermáticos sin cambiar tamaño. El agregado de heparina favoreció descondensación, promoviendo aparición de núcleos más grandes y menos fluorescentes debido a pérdida de protaminas. La intensidad de fluorescencia de núcleos pequeños no descondensados expuestos a glutatión y heparina, aumentó respecto al glutatión solo (101±14 vs. 132±12 unidades arbitrarias; n=8). Esto no se observó con DTT. Demostramos que en la descondensación cromatínica del espermatozoide humano in vitro, la heparina actúa como aceptor de protaminas y además favorece la tiorreducción de las mismas por el glutatión. Además, demostramos la presencia de HS en estadios tempranos del desarrollo folicular humano, lo que correlacionaría con el rol fundamental de esta molécula en el ovocito para asegurar una correcta descondensación y así una fecundación exitosa.