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EFECTO DE LA ANANDAMIDA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA OXIDO NÍTRICO SINTASA UTERINA DURANTE LA IMPLANTACIÓN. Sordelli MS, Farina MG, Billi S, Franchi AM, Ribeiro ML. Laboratorio de Fisiopatología de la Preñez y el parto, CEFYBO, Facultad de Medicina (CONICET-UBA), Buenos Aires, Argentina. El proceso de implantación puede definirse como el establecimiento de una comunicación efectiva tanto de carácter físico como fisiológico entre el blastocito y el endometrio materno. La implantación constituye un paso crucial para el establecimiento de una preñez exitosa. Además, fallas en la implantación poseen consecuencias en la gestación tardía. Es sabido que en la especie humana, solamente el 30% de los embriones fecundados se implanta. De las pérdidas embrionarias durante la gestación temprana, 1/3 se detecta mientras que el resto no presenta manifestaciones clínicas. En nuestro laboratorio estudiamos algunos de los mecanismos fisiopatológicos involucrados en el proceso de implantación. El óxido nítrico y la anandamida se han identificado como dos importantes mediadores de este proceso. El óxido nítrico (NO) es un radical libre gaseoso que se sintetiza por la acción de la óxido nítrico sintasa (NOS). Hasta el momento se han identificado tres isoformas de la NOS, dos calcio-calmodulina dependientes (eNOS y nNOS) y una calcio-calmodulina independiente (iNOS). Durante la implantación, se ha detectado a la eNOS en la decidua que rodea el embrión, la iNOS en el cono ectoplacentario, mientras que la nNOS se localiza en el miometrio. Se sabe que tanto altas concentraciones de NO como bajas concentraciones del mismo son deletéreas para el proceso de implantación, indicando que el proceso de implantación requiere de una fina regulación en la producción de NO. La NOS está regulada por esteroides sexuales, por prostaglandinas, por citoquinas y por calcio-calmodulina. En los últimos años se ha observado que la actividad de la NOS puede ser modulada por otro mediador, la anandamida. La anandamida (AEA) es el análogo endógeno del (-)∆9-tetrahidrocannabinol, el principal componente psicoactivo de la marihuana. La AEA ejerce sus efectos a través de los receptores de cannabinoides CB1 y CB2, además de los receptores para vanilloides conocidos como TRPV. Se ha descrito que el útero de ratón contiene la mayor concentración de AEA registrada en tejidos de mamíferos. El tratamiento in vitro con AEA inhibe el desarrollo de embriones de dos células al estadio de blastocito y la administración i.p. de AEA disminuye el porcentaje de implantación. Ambos efectos están mediados a través de los receptores CB1. El contenido de AEA en los sitios de implantación es menor que en los intersitios, lo que se corresponde con lo observado en nuestro laboratorio con respecto a la síntesis de este mediador. Por lo tanto, en base a estos antecedentes nuestra hipótesis de trabajo fue: La AEA modula la actividad de la NOS en el útero en el período peri-implantatorio. Para demostrar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos: 1- Caracterizar la actividad de la NOS uterina en el período peri-implantatorio. 2- Investigar el efecto de la AEA sobre la actividad de la NOS en este período. Caracterización de la actividad de la NOS uterina en el período peri-implantatorio. La implantación del embrión se asemeja a una reacción inflamatoria, con infiltración de leucocitos, vasodilatación y edema. Estas modificaciones locales en los sitios implantatorios son esenciales para la generación del tejido decidual, e involucran la producción uterina y embrionaria de diferentes agentes vasoactivos. Dado que el NO es un relajante de la musculatura lisa e incrementa el flujo sanguíneo afectando la permeabilidad capilar, se ha postulado al NO como uno de los moduladores del proceso implantatorio. En base a estos antecedentes decidimos estudiar en primer lugar la actividad de la NOS durante el período peri-implantatorio, de manera de establecer si existe una regulación diferencial en la actividad de esta enzima antes, durante y después de la implantación, sugiriendo así su participación en este proceso. Observamos que el tejido uterino presentó actividad de NOS durante todo el período peri-implantatorio. La síntesis de NO se mantuvo constante en los días 4 y 5 de preñez, así como también en los sitios de implantación (d6 IM) obtenidos en el día 6 de gestación. Para llevar adelante este objetivo hembras adultas de la cepa Wistar se aparearon con machos adultos de la misma cepa. Se consideró el día 1 de preñez aquel en el que se observaron espermatozoides en el fluido vaginal. Se sacrificaron hembras en días 4, 5 y 6 de gestación. Se extrajeron los cuernos uterinos. En el día 6 se separaron los sitios de implantación de los intersitios. Se procedió a determinar la actividad de la NOS por la técnica de Bredt&Snyder. Por el contrario, la actividad de la NOS en los sitios interimplantatorios (d6 II) disminuyó significativamente con respecto al resto de los días estudiados (***p< 0.001). Dado que en el día 6 de gestación la actividad de la NOS fue mayor en los sitios de implantación, donde está presente el blastocito, con respecto a los intersitios, decidimos estudiar si el blastocito estaba mediando esta modulación sobre la síntesis de NO. Para ello, en primer lugar estudiamos la actividad de la NOS en los modelos de implantación tardía (hembras Wistar preñadas en día 4 fueron ovariectomizadas, tratadas con vehículo, P (2 mg/kg) o E (0.1 mg/kg) y sacrificadas en el día 8 de gestación) y de pseudopreñez (psp, hembras prepúberes recibieron 50 UI de gondatrofina coriónica equina y se sacrificaron en los días 4 a 6 de psp). En el modelo de psp, en el que no hay embriones en el tracto reproductivo, observamos que la actividad de la NOS no difirió significativamente entre los días 4, 5 y 6, sugiriendo que en ausencia del blastocito la producción de NO en el útero no se encuentra regulada como sí se observa durante la preñez control. Por otro lado, utilizando el modelo de implantación tardía es posible establecer si la activación del blastocito modifica los mediadores uterinos que participan durante la implantación. Los resultados obtenidos mostraron que la actividad de la NOS fue significativamente mayor en las hembras tratadas con E2 o con P4 (***p<0.001), comparadas con las hembras control. La actividad de la NOS no difirió entre el tratamiento con E2 o con P4. Estudio del efecto de la AEA sobre la actividad de la NOS uterina en el período peri-implantatorio. Como observamos previamente, la actividad de la NOS se encuentra regulada durante el período peri-implantatorio en el útero de rata preñada y el blastocito participa de este mecanismo regulatorio. Resultados previos de nuestro laboratorio y de otros autores, indican que la síntesis de AEA en el útero de rata gestante también se encuentra modulada durante la gestación temprana. Ahora bien, cuando comparamos el perfil de síntesis de AEA con el de la actividad de la NOS, se observa que los mismos se correlacionan de manera inversa. Es decir que, mientras que la actividad de la NOS se mantiene elevada en los sitios de implantación y disminuye en los sitios interimplantatorios, la síntesis de AEA es mayor en los sitios interimplantatorios con respecto a los implantatorios. En base a estos resultados, el siguiente objetivo fue estudiar si la AEA modulaba la actividad de la NOS en el útero de rata durante el período peri-implantatorio. Se ha informado la presencia de una de las enzimas que sintetizan AEA, la NAPE-PLD, y de la enzima que la degrada, en embriones y blastocitos murinos. Por ello, utilizamos el modelo de psp de manera de descartar al blastocito como una posible fuente de AEA. Para llevar adelante este objetivo se abordaron dos estrategias: en primer lugar se realizaron estudios in vitro y luego se analizó la modulación que ejerce la AEA sobre la actividad de la NOS en estudios in vivo. Para los estudios in vitro, fragmentos uterinos provenientes de hembras en días 4, 5 y 6 de psp se incubaron con diferentes concentraciones de AEA (10-7, 10-8 y 10-9M) durante 15 y 30 min. Observamos que la incubación con AEA 10-9M durante 15 min inhibió la actividad de la NOS solamente en el útero proveniente de hembras en día 5 de psp y que este efecto se revertía solamente cuando se co-incubaba con SR144528 (10-9 y 10-10M), un antagonista selectivo de los receptores CB2. El análisis de los resultados in vitro sugiere que la AEA ejerce un efecto inhibitorio sobre la actividad de la NOS en el día de la implantación, y que dicho efecto estaría mediado a través de los receptores CB2. Datos previos de nuestro laboratorio indican que la administración in vivo de AEA en una dosis de 0.03 mg/kg modula la tasa de reabsorción embrionaria durante la gestación temprana en ratones preñados. Por otro lado, en el presente trabajo hemos observado que la incubación con AEA inhibió la actividad de la NOS solamente en el útero proveniente de hembras en día 5 de psp. En base a estos resultados, decidimos estudiar el efecto de la administración de AEA in vivo sobre la actividad de la NOS uterina en hembras pseudopreñadas de día 5. Para ello, se administró una dosis única i.p. de AEA 0.03 mg/kg a ratas en día 5 de psp. Las hembras controles recibieron el mismo volumen de vehículo en el que se disolvió la AEA. Ambos grupos de animales se sacrificaron a los 5, 15 y 30 min post-inyección. Los tiempos de sacrificio se seleccionaron en base a la vida media corta que presenta la AEA. Observamos que la AEA in vivo inhibe la actividad de la NOS a los 15 min de administrada (*p<0.05), mientras que no se observó ningún efecto cuando los animales fueron sacrificados a los 5 y a los 30 min. De esta manera, el efecto inhibitorio sobre la actividad de la NOS observado para la AEA in vitro se observa también cuando la AEA se administra in vivo en el día 5 de psp. Dado que el tratamiento in vivo con AEA inhibió la actividad de la NOS, nuestro siguiente objetivo fue establecer cual de los receptores de cannabinoides, CB1 y/o CB2, estaba participando del efecto de la AEA. Para ello, se evaluaron tres dosis diferentes del antagonista de CB1, SR141716A, y del antagonista de CB2, SR144528: 0.3 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg. Observamos que el tratamiento in vivo con el antagonista de CB1 en presencia de AEA, no revirtió la inhibición ejercida por la dosis de 0.03 mg/kg de AEA sobre la actividad de la NOS. Este resultado se repitió para las tres dosis de SR141716A utilizadas. Sin embargo, el tratamiento con SR144528, el antagonista de CB2, en una dosis de 10 mg/kg revirtió completamente el efecto inhibitorio de la AEA sobre la actividad de la NOS en el útero de ratas pseudopreñadas de día 5. La administración de 0.3 mg/kg y 3 mg/kg de SR144528 no tuvieron efecto. Por lo tanto, el efecto inhibitorio de la AEA sobre la actividad de la NOS se encuentra mediado por el receptor de CB2, tanto in vitro como in vivo. Conclusiones generales. A partir de estos resultados podemos decir que: · En el útero de rata gestante, la actividad de la NOS se encuentra elevada en los sitios de implantación, mientras que disminuye en los intersitios. Además, el blastocito tanto en su estado activo como quiescente aumentan la actividad de la NOS mantienen elevada la actividad de esta enzima. · En el modelo de pseudopreñez, la AEA inhibe la actividad de