Nuevo mecanismo de regulación involucrado en la capacitación espermática: participación del proceso de exclusión de AMPc a través del transportador MRP4

. CLAUDIA OSYCKA-SALUT, FEDERICO DIEZ, JULIANA BURDET, MARIA GRACIA GERVASI, ADRIÁN MUTTO, LILIANA BIANCIOTTI, ANA FRANCHI, CARLOS DAVIO Y SILVINA PEREZ MARTINEZ

Buenos Aires

Jornada; JOrnadas SAIC 2013: Oocitos y Espermatozoides: Nuevas miradas en el estudio de la Fecundación; 2013

SAIC

La capacitación espermática se correlaciona con cambios estructurales y bioquímicos en el espermatozoide que involucra, entre otros, un incremento en los niveles de AMPc. A su vez, en otros tipos celulares, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas el AMPc es excluido por proteínas de resistencia a multidrogas (MRPs), en particular MRP4, regulando la homeostasis celular. El objetivo del trabajo fue estudiar la participación del proceso de exclusión de AMPc, vía MPR4, en el proceso de capacitación inducida por bicarbonato en bovinos. Se realizaron experimentos de capacitación in vitro de espermatozoides bovinos criopreservados incubados con bicarbonato 40 y 70 mM, probenecid (inhibidor de MRPs), y DPCPX (antagonista del receptor purinérgico (A1R)). La evaluación de la capacitación fue realizada mediante las técnicas de clorotetraciclina y de inducción de la reacción acrosomal por lisofosfatidilcolina. Los niveles intra y extracelulares de AMPc fueron detectados mediante un ensayo de unión a PKA y posterior dosaje de AMPc. La incubación de los espermatozoides con bicarbonato 40 y 70mM incrementó el patrón capacitado y los niveles de AMPc a nivel intra y extracelular (p<0,01). La exclusión de AMPc fue detectada aún en ausencia de IBMX (inhibidor de fosfodiesterasas) sugiriendo que este mecanismo ocurre durante la capacitación en condiciones fisiológicas (p<0,01). La presencia de KH7 (inhibidor de adenilato ciclasa soluble) disminuyó la producción de AMPc en el medio intra y extracelular e inhibió la capacitación inducida por bicarbonato (p<0,01). Asimismo, el bloqueo de MRPs, incrementó los niveles intracelulares e inhibió la exclusión de AMPc en el espermatozoide y disminuyó la capacitación inducida por bicarbonato (p<0,01). Por otro lado, la incubación con AMPc extracelular incrementó el patrón capacitado de los espermatozoides, la liberación de los mismos del epitelio oviductal y la tasa de fecundación in vitro, sugiriendo un efecto capacitante del nucleótido cíclico. Además el AMPc extracelular revirtió el efecto de probenecid sobre la capacitación inducida por bicarbonato (p<0,01). Para evaluar el mecanismo de acción del AMPc extracelular estudiamos la participación de A1R. El bloqueo de A1R disminuyó el efecto capacitante tanto de bicarbonato como de AMPc (p<0,01). Por último, se evaluó la expresión de MRP4 en espermatozoides bovinos y humanos por western-blot, RT-PCR e inmunocitoquímica. MRP4 fue localizado en la región post-acrosomal y en la cola del espermatozoide, al igual que la localización informada para A1R. Los resultados sugieren que la exclusión de AMPc, posiblemente vía MRP4, y la activación de A1R, regulan eventos asociados a la capacitación inducida por bicarbonato indicando por primera vez un rol paracrino/autocrino de AMPc en espermatozoides bovinos.