INGEBI   02650
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN INGENIERIA GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR "DR. HECTOR N TORRES"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
PCR en Tiempo Real. Perspectivas
Autor/es:
ALEJANDRO G. SCHIJMAN
Lugar:
Coquimbo, IV Region Chile
Reunión:
Simposio; Simposio Centenario de la Enfermedad de Chagas; 2009
Institución organizadora:
Universidad de Chile
Resumen:
En consorcio formado por INGEBI-CONICET, (CeNDIE) ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán; CIMPAT, Univ de los Andes (Bogotá, Colombia), Lab. Biologia Molecular e Doenças Endêmicas, Inst. Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ (Rio de Janeiro, Brazil) y Laboratorio de Serodiagnóstico para Enfermedad de Chagas, Univ. Federal de Goias (Goiania, Brazil), con el apoyo de WHO-TDR y PAHO, organizamos un estudio multicéntrico para evaluar protocolos de PCR para diagnóstico molecular de infección por T. cruzi. En este estudio intervinieron 29 centros y laboratorios de Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Guyana Francesa, México, Perú, Venezuela, Uruguay, Estados Unidos, España, Bélgica, Francia y Reino Unido. A cada uno de ellos se les envió tres paneles de muestras a ciegas (N= 70) para que sean procesadas siguiendo sus métodos de rutina: un panel formado por diluciones seriadas de ADN de cepas de referencia de T.cruzi, X-10 (Tc I), Cl Brener (Tc IIe) y CAN III (Tc III) y controles negativos, otro panel formado por sangre no infectada contaminada con diluciones de parásitos de cultivo y un tercer panel formado por muestras seropositivas y seronegativas de individuos de Argentina, Bolivia y Brasil. Un total de 48 métodos de PCR fueron informados por 27 laboratorios participantes, usando como blancos moleculares secuencias de minicirculo, ADN satélite, ARN ribosomal, secuencias del miniexon y miitocondriales, usando termociclados convencionales o PCR en tiempo real. De este estudio multicentrico se seleccionaron cuatro métodos de PCR que arrojaron los mejores resultados de especificidad y sensibilidad en los tres paneles, entre ellos dos métodos de PCR en tiempo real.  En el marco de un Taller realizado en INGEBI en Noviembre 2008, 18 operadores representantes de los laboratorios participantes en el ensayo multicéntrico, manipularon un panel de muestras con distinta carga parasitaria y evaluaron la sensibilidad y especificidad de los métodos mencionados. La especificidad y sensibilidad de la PCR en tiempo real para secuencia satélite obtenida en el taller fue de 88% y 100%, respectivamente cuando la extracción del ADN fue por solventes orgánicos y de 100% y 78%, respectivamente cuando la extracción fue por columna de silica-gel. El taller permitió definir mejores prácticas de PCR y armonizar los procedimientos y controles de calidad entre todos los laboratorios interesados. Esto servirá de punto de partida para validar la PCR en distintos escenarios clinicos y epidemiológicos y diseñar métodos automatizados. Un consorcio formado por INGEBI-CONICET, (CeNDIE) ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán; CIMPAT, Univ de los Andes (Bogotá, Colombia), Lab. Biologia Molecular e Doenças Endêmicas, Inst. Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ (Rio de Janeiro, Brazil) y Laboratorio de Serodiagnóstico para Enfermedad de Chagas, Univ. Federal de Goias (Goiania, Brazil), con el apoyo de WHO-TDR y PAHO, organizamos un estudio multicéntrico para evaluar protocolos de PCR para diagnóstico molecular de infección por T. cruzi. En este estudio intervinieron 29 centros y laboratorios de Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Guyana Francesa, México, Perú, Venezuela, Uruguay, Estados Unidos, España, Bélgica, Francia y Reino Unido. A cada uno de ellos se les envió tres paneles de muestras a ciegas (N= 70) para que sean procesadas siguiendo sus métodos de rutina: un panel formado por diluciones seriadas de ADN de cepas de referencia de T.cruzi, X-10 (Tc I), Cl Brener (Tc IIe) y CAN III (Tc III) y controles negativos, otro panel formado por sangre no infectada contaminada con diluciones de parásitos de cultivo y un tercer panel formado por muestras seropositivas y seronegativas de individuos de Argentina, Bolivia y Brasil. Un total de 48 métodos de PCR fueron informados por 27 laboratorios participantes, usando como blancos moleculares secuencias de minicirculo, ADN satélite, ARN ribosomal, secuencias del miniexon y miitocondriales, usando termociclados convencionales o PCR en tiempo real. De este estudio multicentrico se seleccionaron cuatro métodos de PCR que arrojaron los mejores resultados de especificidad y sensibilidad en los tres paneles, entre ellos dos métodos de PCR en tiempo real.  En el marco de un Taller realizado en INGEBI en Noviembre 2008, 18 operadores representantes de los laboratorios participantes en el ensayo multicéntrico, manipularon un panel de muestras con distinta carga parasitaria y evaluaron la sensibilidad y especificidad de los métodos mencionados. La especificidad y sensibilidad de la PCR en tiempo real para secuencia satélite obtenida en el taller fue de 88% y 100%, respectivamente cuando la extracción del ADN fue por solventes orgánicos y de 100% y 78%, respectivamente cuando la extracción fue por columna de silica-gel. El taller permitió definir mejores prácticas de PCR y armonizar los procedimientos y controles de calidad entre todos los laboratorios interesados. Esto servirá de punto de partida para validar la PCR en distintos escenarios clinicos y epidemiológicos y diseñar métodos automatizados. Determinación de carga parasitaria. Determinación de carga parasitaria. Hemos desarrollado un sistema de PCR en tiempo real cuantitativo para determinar carga parasitaria en muestras de sangre periférica usando como blanco molecular la secuencia satélite y primers modificados para aumentar la capacidad de reconocimiento de los distintos linajes parasitarios. Para mejorar la precisión de la cuantificación hemos incorporado al ensayo un plásmido recombinante linearizado como estandar interno que se agrega a la muestras de sangre original y se utiliza para normalizar el valor crudo de carga parasitaria según el rendimiento de la extracción de ADN de la muestra sanguínea y  la eficiencia de amplificación. Este procedimiento fue ensayado en el monitoreo de 38 pacientes pediátricos con tratamiento con benznidazol. También fue usado para seguir la dinamica de la parasitemia en pacientes sometidos a transplante cardiaco con riesgo de reactivación por inmunosupresión. Esta metodología está siendo evaluada en estudios con muestras de tejido humanas y murinas y en pacientes con transplante renal. Hemos desarrollado un sistema de PCR en tiempo real cuantitativo para determinar carga parasitaria en muestras de sangre periférica usando como blanco molecular la secuencia satélite y primers modificados para aumentar la capacidad de reconocimiento de los distintos linajes parasitarios. Para mejorar la precisión de la cuantificación hemos incorporado al ensayo un plásmido recombinante linearizado como estandar interno que se agrega a la muestras de sangre original y se utiliza para normalizar el valor crudo de carga parasitaria según el rendimiento de la extracción de ADN de la muestra sanguínea y  la eficiencia de amplificación. Este procedimiento fue ensayado en el monitoreo de 38 pacientes pediátricos con tratamiento con benznidazol. También fue usado para seguir la dinamica de la parasitemia en pacientes sometidos a transplante cardiaco con riesgo de reactivación por inmunosupresión. Esta metodología está siendo evaluada en estudios con muestras de tejido humanas y murinas y en pacientes con transplante renal. Tipificación molecular de linajes de Trypanosoma cruzi en muestras biológicas Tipificación molecular de linajes de Trypanosoma cruzi en muestras biológicas Se diseñó un algoritmo de PCR multiplex para discriminar entre las 6 unidades de tipificación discreta de Tripanosoma cruzi, recientemente denominadas TcI a TcVI en el marco de un consenso alcanzado en el segundo simposio satélite de nomenclatura de T.cruzi en Buzios, Brasil en agosto de 2009 (Zingales y col, Mem. Inst.Osw. Cruzi en prensa). Se diseñaron primers y sondas Taq Man hacia la región intergénica del miniexón, hacia genes para ARN ribosomal 18 S y secuencia codificantes de la citocromo oxidasa II mitocondrial, en base al alineamiento de secuencias en el Gen Bank. Se diseñó un algoritmo de PCR multiplex para discriminar entre las 6 unidades de tipificación discreta de Tripanosoma cruzi, recientemente denominadas TcI a TcVI en el marco de un consenso alcanzado en el segundo simposio satélite de nomenclatura de T.cruzi en Buzios, Brasil en agosto de 2009 (Zingales y col, Mem. Inst.Osw. Cruzi en prensa). Se diseñaron primers y sondas Taq Man hacia la región intergénica del miniexón, hacia genes para ARN ribosomal 18 S y secuencia codificantes de la citocromo oxidasa II mitocondrial, en base al alineamiento de secuencias en el Gen Bank. Se diseñó un algoritmo de PCR multiplex para discriminar entre las 6 unidades de tipificación discreta de Tripanosoma cruzi, recientemente denominadas TcI a TcVI en el marco de un consenso alcanzado en el segundo simposio satélite de nomenclatura de T.cruzi en Buzios, Brasil en agosto de 2009 (Zingales y col, Mem. Inst.Osw. Cruzi en prensa). Se diseñaron primers y sondas Taq Man hacia la región intergénica del miniexón, hacia genes para ARN ribosomal 18 S y secuencia codificantes de la citocromo oxidasa II mitocondrial, en base al alineamiento de secuencias en el Gen Bank. Hasta el momento se logró poner a punto la PCR multiplex para secuencias intergénicas de miniexon - que permiten distinguir Tc1, Tc II (DTU IIb), Tc III (DTU IIc),  Tc IV (DTU IIa) y Tc híbridos V/VI (IId/IIe) una secuencia heteróloga clonada en plásmido como control interno del procedimiento mediante pruebas con 10 sondas Taq man y 27 sondas por Luminex. El Luminex es una tecnología novedosa cuyo potencial radica en la capacidad del análisis automatizado simultáneo de gran número de muestras y genotipos. Acopla microesferas a oligonucleótidos que permiten detectar amplicones específicos. Las microesferas son reconocidas por dos detectores láser utilizando tecnología análoga a la citometría de flujo, permitiendo discriminar simultáneamente entre 100 microesferas secuencia-específicas. La especificidad de las sondas diseñadas para cada tipo de ensayo fue evaluada utilizando ADN de cultivo de stocks de referencia para cada grupo de T. cruzi. La sensibilidad fue evaluada en muestras de sangre reconstituida, obteniéndose un limite de detección de 5 parásitos/mL para ambos ensayos. Finalmente, hemos iniciado experimentos comparativos de tipificación de muestras de heces de triatominos infectados con método de PCR en tiempo real y PCR convencionales publicadas previamente por el laboratorio (Burgos y col, I.J.Parasitol. 2007). El objetivo final de este enfoque es el análisis directo de muestras biológicas y clínicas, que será puesto en marcha una vez se optimicen las condiciones de mayor sensibilidad analítica y poder resolutivo de ambas metodologías actualmente en evaluación.