CROMOSOMAS ARTIFICIALES COMO PLATAFORMA PARA LA EXPRESIÓN DEL SISTEMA CRISPR/CAS9 EN TRYPANOSOMA CRUZI

GUILLERMO D. ALONSO; MATIAS ROMERO VICTORICA; MARÍA DE LOS ÁNGELES CURTO; ALEJANDRO G. SCHIJMAN

Santa Fe

Congreso; XXVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias; 2016

SAP

El avance en el conocimiento de la biología básica de los tripanosomátidos ha sido posible, en gran medida, gracias al desarrollo de herramientas de manipulación genética. Los vectores disponibles incluyen constructos que se integran al genoma y aquellos que permanecen como episomas. Recientemente ha despertado gran interés el sistema CRISPR/Cas9 que funciona como un ?sistema inmune? en bacterias que se ha utilizado para la edición de genomas en diversos organismos. Dado que T. cruzi, a diferencia de otros tripanosomátidos, no posee un mecanismo de silenciamiento por ARN de interferencia, éste nuevo sistema CRISPR/Cas9 resulta particularmente atractivo. El vector pTREX fue el primer sistema abordado para la expresión de la nucleasa Cas9 en T. cruzi; sin embargo, sus elevados niveles de expresión determinaron que ésta construcción resultara tóxica para el parásito. Anteriormente hemos desarrollado un cromosoma artificial, denominado pTAC, que además de tener secuencias teloméricas posee algunas características interesantes: capacidad de mantenerse sin selección, no integrarse al genoma, no contener promotores y presentar niveles de expresión fisiológicos. Es por ésta razón que decidimos comparar el desempeño de líneas de T. cruzi transfectadas con la construcción pTREX/Cas9 con respecto a pTAC/Cas9. Además pusimos a prueba el sistema CRISPR transfectando epimastigotes con las construcciones pTREX/Cas9/PFR2 y pTAC/Cas9/PFR2, direccionando la actividad de la nucleasa Cas9 al gen que codifica para uno de los componentes del entramado paraflagelar. Se amplificaron 2 fragmentos, Cas9 y Cas9/sgPFR2, a partir de los vectores Cas9/pTREX-n y sgPFR2/Cas9/pTREX-b respectivamente, cedidos gentilmente por el Dr. R. Docampo (University of Georgia, Athens, U.S.A.), utilizando oligonucleótidos con secuencias conteniendo el sitio de restricción KpnI. Los fragmentos de 5,5 y 5,6kb respectivamente se clonaron en vectores pGEM-T Easy. Se digirieron ambos pTAC y pGEM-T/Cas9 con KpnI, para luego ligar los fragmentos conteniendo Cas9 al cromosoma artificial. Ya ligados, se realizó una PCR para verificar la correcta orientación de los insertos, se linealizaron digiriendo con HindIII y se transfectaron epimastigotes de T. cruzi correspondientes a Las unidades discretas de tipificación TcI y TcVI. Las poblaciones transfectadas están bajo el proceso de selección, luego del cual se procederá a la evaluación de sus fenotipos.