Trypanosoma cruzi Cytochrome P450 reductases: Structural and Biological characterization.

PORTAL PATRICIO, SCHLESINGER MARIANA,DE VAS MATIAS, FERNÁNDEZ VILLAMIL SILVIA, ALONSO GUILLERMO, TORRES HÉCTOR, FLAWIÁ MIRTHA, PAVETO CRISTINA

Villa Carloz Paz, Cordoba, Argentina.

Congreso; XLIV Reunion Anual Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular.; 2008

Sociedad Argentina de Investigaciones Bioquimicas

Recientemente hemos identificado en Trypanosoma cruzi tres genes que codifican para reductasas de citocromo P450: - TcCPR-A, TcCPR B y TcCPR-C. Sus secuencias aminoacídicas presentan los dominios característicos de unión a FMN, FAD y NADPH, y comparten un 11% de identidad difiriendo principalmente en sus extremos amino-terminal. Las tres enzimas han sido clonadas y expresadas en bacterias determinándose que reducen al citocromo c en forma dependiente de NADPH y que esta actividad es inhibida parcialmente por DPI (inhibidor de flavoproteínas). Con el fin de identificar el rol de TcCPR-A en el metabolismo redox del parásito, se continuó con la caracterización bioquímica y estructural de esta reductasa. Para producir la proteína soluble con alto grado de pureza y rendimiento se puso a punto un sistema de co-expresión con chaperonas. La co-transformación con el vector pKJE7 que expresa la chaperona dnaK-dnaJ-grpE con pET-TcCPR-A resultó la mejor combinación permitiendo obtener un alto porcentaje en el citosol bacteriano. Con la proteína purificada a través de columnas de Ni-NTA agarosa y dializada para eliminar la contaminación con flavinas libres, se realizaron ensayos de actividad para comprobar la dependencia por los cofactores. El espectro de absorción en la región del visible mostró los picos máximos característicos de una flavoproteína y se obtuvo un coeficiente de extinción a 280 nm de 75830 M-1 cm-1. Actualmente se esta estudiando por HPLC la presencia de FAD y FMN en la proteína recombinante pura.