POLY(ADP-RIBOSA) POLIMERASA DE TRYPANOSOMA BRUCEI ES SELECTIVAMENTE ACTIVADA POR ADN

MARIANA SCHLESINGER; EZEOGO OBAJI; LARI LEHTIÖ; TEEMU HAIKARAINEN; SILVIA FERNANDEZ VILLAMIL

Santa Fe

Congreso; XXVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias; 2016

Sociedad Argentina de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias

Trypanosoma brucei posee una única poli(ADP-ribosa)polimerasa (TbPARP) que utiliza NAD+ como sustrato para formar polímeros de ADP-ribosa. Previamente demostramos que esta enzima citoplasmática es capaz de migrar al núcleo luego del tratamiento con peróxido de hidrógeno y se activa en respuesta al ADN dañado, por lo que podría actuar como un sensor de daño genómico. hPARP-1 (humana) posee tres dominios dedos de Zn que le permiten su unión al ADN, mientras que hPARP-2 y 3 lo hacen a través de un dominio N-terminal rico en aminoácidos básicos. El extremo N-terminal de TbPARP es rico en Lys por lo que postulamos que podría mediar la interacción con el ADN. Analizamos la unión al ADN de la proteína completa (FL) o fragmentos (N, NW, WRA, RA), siendo N dominio amino terminal, W y R posibles dominios regulatorios y A dominio ADP-ribosa transferasa, por EMSA utilizando varios oligonucleótidos doble cadena de ADN. El dominio N no fue estrictamente necesario pero sí incrementó la unión al ADN, aunque cuando ambos dominios N y W fueron omitidos la unión se inhabilitó casi en forma completa. N también fue requerido para la actividad enzimática, medida como desaparición de NAD+ por fluorometría. Evaluamos si la autoADP-ribosilación y la generación de polímeros cargados negativamente sobre TbPARP disocian la enzima del complejo como un mecanismo de regulación. La incubación de FL con NAD+ disoció el complejo previamente formado con ADN, siendo este efecto revertido en presencia de EB-47, un inhibidor de la actividad de PARP. Para identificar el oligonucleótido activador se utilizaron varias estructuras de oligos de ADN. Los oligos no fosforilados fueron pobres activadores, mientras que solo algunas estructuras fosforiladas resultaron activadores fuertes. El ADN doble cadena o en horquilla con extremos 3´o 5´ overhangs fosforilados activaron fuertemente a la enzima, mientras que la fosforilación no cambió las propiedades de activación del ADN simple cadena o doble cadena con extremos romos (ss-ADN, ds-ADN, horquilla u otra estructura).Basados en el requerimiento específico de ciertos templados para su activación, postulamos que TbPARP no funcionaría como una proteína global de sensado de daño genómico como hPARP-1, sino que estaría involucrada en ciertos tipos de reparación como hPARP-2 y 3.