INGEBI   02650
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN INGENIERIA GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR "DR. HECTOR N TORRES"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
TcCPR-A: una reductasa de citocromo P450 dependiente de NADPH de Trypanosoma cruzi.
Autor/es:
MARIANA SCHLESINGER, PORTAL PATRICIO, FERNANDEZ VILLAMIL SILVIA, ALONSO GUILLERMO, TORRES HÉCTOR, FLAWIÁ MIRTHA, PAVETO CRISTINA.
Lugar:
Rosario, Argentina
Reunión:
Congreso; VIII Congreso Argentino de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias.; 2008
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Protozoologia
Resumen:
Recientemente hemos  identificado en Trypanosoma cruzi tres genes que codifican para reductasas de citocromo P450: TcCPR-A, TcCPR-B y TcCPR-C. Sus secuencias aminoacídicas comparten un 11% de identidad, difieren principalmente en su extremo amino-terminal y presentan los dominios característicos de unión a FMN, FAD y NADPH. Las tres enzimas reducen al citocromo c en forma dependiente de NADPH y se inhiben parcialmente por el inhibidor de flavoproteinas (DPI) (Portal et al, 2008). Dichas enzimas han sido clonadas y expresadas en bacterias, y una de ellas, TcCPR-B, sobreexpresada en epimastigotes de T.cruzi. El presente trabajo profundiza en la caracterización bioquímica y estructural de TcCPR-A, con el fin de identificar su rol en el metabolismo redox del parásito. Para ello, primero se puso a punto un sistema de expresión adecuado para producir la proteína soluble con alto grado de pureza y rendimiento. Se probaron diferentes construcciones en el vector con combinación de secuencias que codifican para diferentes chaperonas. Una de ellas, pAKMLNdnaJKK, resulto la mejor combinación para obtener  el mayor % de TcCPRA  en el citosol bacteriano. Con la proteína purificada a través de columnas de NiNTA agarosa y dializada para eliminar la contaminación con flavinas libres, se realizaron ensayos de actividad para comprobar la dependencia del agregado de los cofactores. Se registró el espectro de absorción en la región del visible con el objeto de obtener mas información acerca de la estructura y composición de la proteína ya que el análisis de su secuencia predice la presencia de flavinas unidas a la apoproteina. Se analizó por HPLC la presencia de FAD y FMN en la proteína recombinante pura.