ACCURATE REAL-TIME PCR STRATEGY FOR MONITORING BLOODSTREAM PARASITIC LOADS IN CHAGAS DISEASE PATIENTS UNDER ETIOLOGICAL TREATMENT

DUFFY, T.,; BISIO, M.,; ALTCHEH, J.,; BURGOS, J.M.,; DIEZ, M.,; LEVIN, M.J.,; FAVALORO, R.,; FREILIJ, H.,; SCHIJMAN A.G.

Águas de Lindóia-Sao Pablo,

Congreso; “XXXVI Annual Meeting on Basic Research in Chagas Disease”.; 2008

Sociedad brasileña de Protistas

Introducción: La cuantificación de Trypanosoma cruzi en muestras biológicas por un método sensible y preciso es importante para evaluar la efectividad de nuevas drogas anti-tripanocidas así como para el seguimiento de pacientes con reactivación chagásica por inmunosupresión. Objetivos: Desarrollar un método de cuantificación e identificación simultanea de los principales linajes de T. cruzi en muestras de sangre y tejido humano y murino. Metodología: Seleccionamos como blanco de amplificación la secuencia repetitiva nuclear satélite por presentar las siguientes características: 1) se halla altamente conservada, 2) esta repetida  en alrededor 100.000 copias por genoma, 3) presenta regiones diferenciales entre los linajes T. cruzi I y T. cruzi II. En base a un análisis de secuencias diseñamos primers que amplifican un fragmento diferencial entre ambos grupos generando un amplicón con distinta temperatura de desnaturalización post-PCR que permite tipificar el linaje cuantificado. Además, para normalizar los valores obtenidos de diferentes muestras se desarrollo un estándar interno (EI): se agrega a cada muestra de sangre 200pg de un plásmido linealizado con un inserto de Arabidopsis thaliana que permite  calcular la eficiencia de la extracción al cuantificar la masa de plásmido  recuperada. Para normalizar la cuantificación de T.cruzi en tejido se utiliza como referencia el número de células huésped, calculado al amplificar los genes de copia única: ApoB (apolipoproteína B) para muestras humanas y  TNF-α para murinas. Resultados: Se montó un método de cuantificación de ADN de T.cruzi con una eficiencia del 95% en un amplio rango dinámico de 0.01-105 parásitos/ml de sangre humana. Este sistema fue evaluado en el seguimiento de pacientes infectados transplantados cardiacos que sufrieron reactivación chagásica y en pacientes tratados con benznidazol. Además, la PCR-Q permitió medir densidad parasitaria en muestras de placenta humana y en tejidos blanco de ratones infectados con cepas de laboratorio. Discusión: La validación de este sistema en estudios multicéntricos permitirá contar con una herramienta muy valiosa para investigación clínica e histopatológica de la infección por T.cruzi.