Transformación de cloroplastos de tabaco para obtener resistencia a patógenos fúngicos y bacterianos

SEGRETIN, M.E., WIRTH, S., LUPPI, J.P., MENTABERRY, A. Y BRAVO-ALMONACID, F.

Viña del Mar, Chile

Congreso; VI Encuentro Latinoamericano y del Caribe del Biotecnología Agropecuaria. REDBIO2007; 2007

Redbio

La transformación de cloroplastos presenta numerosas ventajas respecto a la transformación nuclear, entre ellas la posibilidad de alcanzar niveles de expresión más elevados, junto con la contención del transgén y la posibilidad de expresar policistrones. Los niveles de expresión potencialmente altos hacen que esta metodología sea especialmente atractiva para la transformación con genes antimicrobianos, cuya efectividad es dosis dependiente. A fin de evaluar la estrategia de transformación plastídica para obtener resistencia a estrés biótico, se utilizó un vector (pBSW5´UTR) previamente desarrollado por nuestro grupo para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum var. Petit Habana. Los genes elegidos para transformar las plantas fueron aquellos que codifican para las proteínas AP24 (una osmotina de tabaco), dermaseptina (Der: un péptido antimicrobiano obtenido de la piel de Phyllomedusa sauvagii ) y glucanasa (Gluc: proteína de respuesta a patógenos de tabaco), todos ellos con comprobada actividad antimicrobiana y/o antifúngica, ya sea solos o combinados, siendo la última opción la más efectiva teniendo en cuenta los antecedentes que utilizan transformación nuclear. En función de ello, se desarrollaron las siguientes construcciones: a) pBSW5´UTR-AP24, b) pBSW5´UTR-Gluc, c) pBSW5´UTR-Der, d) pBSW5´UTR-AP24/Gluc y e) pBSW5´UTR-Der/Gluc, siendo las dos últimas versiones policistrónicas. Con ellas se transformaron plantas de tabaco, obteniendo 5 líneas transplastómicas para cada una de las distintas construcciones. Además, y con el objetivo de comparar cuál es la mejor estrategia de transformación para obtener resistencia a patógenos con los genes mencionados, se transformaron mediante A. tumefaciens, plantas de tabaco a nivel nuclear. Los plásmidos binarios utilizados para la transformación (basados en el pPZP200-Higromicina) dirigen la expresión de las proteínas AP24, Glucanasa y Dermaseptina, al espacio vacuolar, los plásmidos utilizados fueron: a) pPZP200Hyg-AP24v, b) pPZP200Hyg-Glucv, c) pPZP200Hyg-Derv y d) pPZP200Hyg-AP24v-Glucv. Luego de los experimentos de transformación nuclear, se seleccionaron 10 líneas transgénicas para cada construcción. Todas las líneas obtenidas, nucleares y plastídicas, fueron evaluadas por PCR, y actualmente están siendo caracterizadas molecularmente mediante las técnicas de Southern, Northern y Western blot, para ser luego desafiadas con patógenos fúngicos y bacterianos.