ESTUDIO FUNCIONAL DE RECEPTORES RECOMBINANTES ALPHA9ALPHA10 CON MUTACIONES EN EL SITIO DE UNIÓN DE ACETILCOLINA

J SAVINO; P.V. PLAZAS; E. KATZ; A.B. ELGOYHEN

Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina

Congreso; LII Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica. LV Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Inmunología y la Sociedad Argentina de Fisiología.; 2007

Una característica conservada de todos los receptores nicotínicos es la presencia de un puente disulfuro formado por dos cisteínas adyacentes, en la región del sitio de unión de acetilcolina (ACh). Con el objetivo de estudiar el papel de dichos residuos en la funcion del receptor α9α10 se remplazaron estas cisteínas por serinas (C192S,C193S) mediante mutagenesis dirigida y se expresaron las subunidades mutantes en oocitos de Xenopus laevis. Las corrientes producidas por la aplicación de ACh se registraron mediante la técnica de fijacion de voltaje con dos microelectrodos. La presencia de la mutación disminuyó la sensibilidad a ACh y aumentó el coeficiente de Hill (α9α10*: EC50 =107±7.6mM, nH =1.14±0.07, n=3; α9*α10: EC50 =146.7±5.6mM, nH =1.26±0,05, n=5). La sensibilidad al antagonista nicotina resultó afectada observándose un aumento en la IC50 (α9α10*: IC50 = 63.67±17.7 mM, n=2; α9*α10: IC50 = 50.11mM, n=1). Se observó también una disminución en la potencia de otros antagonistas sobre el receptor mutante α9α10* (Estricnina IC50 =46.3±12.5nM, n=2; Atropina IC50 =2.4±0.8mM, n=2; Muscarina IC50 > 100mM, n=1). La tasa de desensibilzación se mantuvo en  α9*α10 (I20sec/Ipico=39.7±3.9%, n=2) pero disminuyó en α9α10* (90.6±5.5%, n=3). Se registraron las corrientes producidas por ACh antes y después de la incubación con un quelante de Ca2+. Se observó que el porcentaje de la corriente remanente en los mutantes es similar al del receptor salvaje (α9*α10 =5.98±1.1%, n=4) demostrando que se mantiene la elevada permeabilidad al calcio del receptor. Por último, no se observaron diferencias en la sensibilidad al voltaje entre los receptores mutantes y los salvajes, obteniéndose curvas I-V similares. En conclusión, la mutación C192S/C193S en el receptor α9α10, estaría afectando la afinidad del sitio de binding o el gating del canal, sin alterar otras características. Asimismo, tanto la subunidad α9 como la α10 pueden aportar la doble C-C al sitio principal de unión al agonista.