La transferencia del gen IFN-B tiene un fuerte efecto antitumoral potenciado por el efecto bystander

ROSSI, ÚRSULA A.; VILLAVERDE, MARCELA S.; GIL CARDEZA, MARÍA L.; GLIKIN, GERARDO C.; FINOCCHIARO, LILIANA M.E.

Mar del Plata

Congreso; SAIC. LVI Reunión Anual; 2011

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Se denomina efecto bystander al fenómeno que extiende la citotoxicidad provocada por una terapia a las células del entorno que no fueron alcanzadas por dicha terapia. Si bien el mecanismo del efecto bystander en la terapia génica con IFN-B no ha sido elucidado, resultados previos propios en células de sarcoma de Ewing, indicarían una posible conexión con el aumento de radicales libres intracelulares y la liberación de anión superóxido.  Se utilizaron tres líneas de melanoma espontáneo canino altamente sensibles al gen cIFNB tanto en cultivos bi- como tri-dimensiónales (Ak: 27.1 ± 2.6 % , 35.8± 1.0%; Ch: 18.3 ± 1.1 %, 16.1 ± 1.1 %; Bk: 48.9± 5.1 %; 38.7 ± 2.7 % de supervivencia respectivamente); basta observar las bajas eficiencias de lipofección para reconocer que la muerte celular  inducida por el gen cIFN-B no se restringe a las células que lo expresan (Ak: 28.6± 0.7%; Ch: 16.7 ± 0.4%; Bk: 3.9 ± 0.2%).  Para comprobar este fenómeno se realizaron cultivos bi- y tri-dimensionales de diferentes diluciones de las células lipofectadas con cIFN-B en cantidades crecientes de células lipofectadas con B-galactosidasa (B-gal) (100, 50, 25 y 10% de células IFN-B), y se determinó si el efecto observado era igual o menor al efecto esperado por dilución. Luego se estudió la existencia de efecto bystander a través de factores liberados al medio por las células lipofectadas. Para esto se obtuvo el medio condicionado (m.c.) 24 h después de las lipofecciones con el gen B-gal, cIFN-B o bien células control, dicho medio se filtró y se agregó a células previamente sembradas en placas de 96 pozos; 4 días después se determinó la viabilidad celular utilizando el método de la fosfatasa ácida (APH), y se relativizó con respecto al m.c. de las células control.  En Ak y Ch se observaron valores menores a los esperados en  todas las diluciones, tanto en cultivos bi- como tri-dimensionales. Aún cuando solo el 10% de las células fueron previamente lipofectadas con el gen terapéutico se conserva un gran efecto citotóxico (p≤0.001). Por otro lado en Bk, no se pudo evidenciar el efecto bystander por este método, dado que el efecto de la dilución resultó bastante similar a lo esperado.  En las tres líneas evaluadas el m.c. resultó altamente citotóxico (p≤0.001). El factor citotóxico presente en el mc demostró ser termo-lábil ya que al pre-calentar el m.c. por 30 m a 72ºC o 4 m a 96ºC se perdió por completo el efecto citotóxico, aunque al precalentar 30 m a 53ºC se conservó el efecto citotóxico. Por otro lado se observó que el m.c. de una línea resistente a cIFN-B (Ol) causó citotoxicidad en Ch, a un nivel similar que su propio medio. Llamativamente el m.c. de células de melanoma humano (M8, A735 y SB2) sensibles a la terapia no produjo ningún efecto citotóxico.  Estos resultados mostraron un gran efecto bystander en las tres líneas estudiadas. Este efecto fue probablemente producido por la liberación de cIFN-B y quizás otros factores por las células lipofectadas hacia las células vecinas. Este efecto constituye una condición sine qua non para la propuesta de la lipofección del gen cIFN-B como una posible terapia génica, dado que in vivo no es posible llegar al 100 % de las células tumorales.