Validación de PCR en tiempo real multiplex con sondas TaqMan para detección de Trypanosoma cruzi en sangre periférica de pacientes con infección crónica

PARRADO, R; BISIO, MMC; VILLARROEL, S; DE LA BARRA, A; RAMIREZ, JC; ALVES F; DUFFY, T; TORRICO F; RIBEIRO I; GARCÍA AL; SCHIJMAN AG

Mar del Plata

Congreso; IX Cngreso de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias; 2011

Sociedad Argentina de Protozoologia

La PCR en tiempo real (qPCR) para detectar T. cruzi abre perspectivas prometedoras como marcador indirecto de eficacia terapéutica de drogas tripanocidas. Hemos desarrollado un sistema de qPCR multiplex con sondas Taqman1 dirigidas a secuencias satélite2 y control interno de amplificación (IAC)3.      El objetivo de este trabajo es validar dicho método. Se  comparó el rendimiento de la extracción de ADN de sangre en buffer Guanidina 6M EDTA 0.2M (GEB) con 2 kits comerciales, obteniendo mejores resultados con 300 uls GEB y columnas Roche. El rango dinámico anticipado4 en diluciones seriadas de ADN total extraído de sangre inoculada con 10000 parásitos/mL (CL Brener (Tc VI)) en ADN extraído de sangre no infectada, fue de 0,128 a 10000 par/mL, eficiencia de 1.10 y coeficiente de determinación (R2>0,98). Se evaluó la precisión realizando 20 ensayos independientes según recomendaciones del “Clinical and Laboratory Standard Institute”, EEUU, utilizando concentraciones cercanas al límite de detección de ADN purificado de CL-Brener y K98 (Tc I) (triplicados intra-ensayo), muestras de sangre artificiales inoculadas con CL-Brener y K98 y sangre de individuos con infección crónica (duplicados intra-ensayo). El estimador de precisión se calculó según la fórmula St=[B2 +(N-1)/N*S2]-2 donde B es estimador de desviación estandar inter–ensayo y S es estimador de repetitividad intra-ensayo. Para 10 fg/ul de CL Brener se obtuvo un St 0.88 (Ct (media±SD)= 29.57±0.87) y para 100 fg/ul de K98 un  St=0.58 (Ct (media±SD)= 28.84±0.55. Se obtuvo un St de 1.57 para CL Brener 0,2 par/mL, un ST 1,88 para K98 2 par/mL y un ST de 0.89 en pool de muestras de pacientes (Ct medio 30,47). Con una concentración de 0.2 par/mL K 98 y pool de muestras de pacientes con CTs>  37,  la positividad  de qPCR fue < 75% (St no calculado). La precisión de la amplificación del IAC en 20 experimentos (14 repeticiones intra-ensayo) fue St: 0.49 (Ct(media±SD)= 20.31±0.68). Se inició la validación clínica del método, evaluando a doble ciego la concordancia de resultados en muestras de pacientes crónicos, procesadas en IBISMED,Cochabamba  (ciclador SLAN), e INGEBI, Buenos Aires (ciclador Rotor-Gene). En  27 de 90 muestras analizadas hasta agosto 2011, la concordancia fue 92.3%. La caracterización de esta qPCR permitió diseñar un procedimiento operativo estándar (POE) para evaluar eficacia de nuevas drogas tripanocidas.