IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Expression, purification and functional characterization of hSLC35B1, the human ATP/ADP exchanger from the endoplasmic reticulum
Autor/es:
BREDESTON LM; SCHWARZBAUM PJ
Lugar:
San Luis
Reunión:
Congreso; Reunion Anual de Sociedad Argentina de Biofisica; 2019
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Biofisica
Resumen:
Expression, purification and functional characterization of SLC35B1, the human ADP/ATP exchanger from the endoplasmic reticulum Pablo J. Schwarzbaum, and Luis M. Bredeston*From the Universidad de Buenos Aires-CONICET, Departamento de Química Biológica-IQUIFIB, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Buenos Aires, Argentina. *bredes@qb.ffyb.uba.ar Abstract El flujo de ATP hacia el lumen del retículo endoplásmico desde el citoplasma, proveniente de las mitocondrias o producto de la glucolisis, es crítico para el funcionamiento de diversas chaperonas que asisten en el plegado durante la síntesis de proteínas. A pesar de la importancia de este proceso, el mecanismo de transporte de ATP no es completamente entendido. Recientemente fue demostrado que la proteína SLC35B1 humana sería la responsable del transporte del ATP al ER por medio de un mecanismo antiporter intercambiando ATP/ADP (Klein, 2018). En este trabajo la proteína SLC35B1 humana fue expresada en levaduras, purificada y reconstituida en liposomas de fosfatildilcolina. La caracterización funcional mostró que puede intercambiar ATP/ADP o ATP/ATP. Llamativamente el estudio de la especificidad utilizando liposomas cargados con diversos nucleótidos e incubados con [32P]ATP indicó que el intercambio ATP/UDP o ATP/UTP ocurre con una velocidad similar al intercambio ATP/ADP, mientras que otros nucleótidos di o trifosfato (GDP, GTP o CTP) lo hacen con menor velocidad. Finalmente, los nucleósidos monofosfatos probados (GMP, AMP, UMP) no son capaces de intercambiar por el ATP externo. Esto sugeriría la relevancia de al menos dos grupos fosfatos en el reconocimiento inicial y/o durante el proceso de transporte. Sin embargo, a juzgar por los resultados es difícil interpretar la relevancia de la base nitrogenada, ya que los derivados de adenina o uridina (purina o pirimidina, respectivamente) no muestran diferencias mientras que los de guanina o citidina (purina o pirimidina, respectivamente) son mucho menos efectivos en el intercambio. Para el estudio de las propiedades cinéticas, el transportador hSLC35B1 purificado se reconstituyó en liposomas cargados con ADP 10mM y se incubó con concentraciones externas de [32P]ATP variables. La captación de [32P]ATP mostró un comportamiento de tipo Michaeliano con una afinidad aparente con una K0.5(ATPe)= 62 uM. Por otro lado liposomas cargados con concentraciones variables de ADP (entre 0-10mM) fueron incubados (5min a 37oC) en presencia de 50uM [32P]ATP. En este caso la captación de [32P]ATP mostró un comportamiento Michaeliano con con una K0.5(ADPi) 5mM. Estos resultados sugieren fuertemente una asimetría en la afinidad por los dos ligandos uM vs mM.Por otro lado estudios de estabilidad térmica hSLC35B1, mediante un ensayo del tipo thermal shift ,mostró un aumento de la estabilidad en presencia de ATP y ADP ( con afinidad en el orden uM) y también con UDP y no con otros nucleótidos.Finalmente, en base a la identidad de secuencia de hB1 y la de secuencias homologas de otros organismo evolutivamente distantes se identificaron cuatro residuos cargados y conservados en los transmembranicos TM4 (K117, K120) y TM9 (R276 y K277). La mutación de dichos residuos por alanina produjo una reducción significativa en la capacidad de intercambio ADP/ATP en las cuatro variantes. Este resultado sugiere que pordrian formar parte de los residuos que coordinan los grupos fosfato.