Participación de la endocitosis mediada por caveolina y rol de los melanosomas en la acción fototóxica de una ftalocianina catiónica de Zn(II) sobre células de melanoma

LEONOR PATRICIA ROGUIN; FEDERICO VALLI; JULIETA VERÓNICA MARINO; MARÍA CECILIA GARCÍA VIOR

Congreso; V GRAFOB - Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos; 2020

El melanoma es la forma más agresiva de cáncer de piel, altamente resistente a los tratamientos convencionales. La terapia fotodinámica (PDT) es una modalidad terapéutica mínimamente invasiva que combina la utilización de un fotosensibilizador, luz visible y oxígeno molecular, para producir especies reactivas del oxígeno que llevan a la destrucción de los tejidos blanco [1].Previamente demostramos que la ftalocianina catiónica de Zn(II) Pc13 es un potente fotosensibilizador que se localiza en los lisosomas y mitocondrias de las células de melanoma B16F0, produciendo su muerte luego de la irradiación (340 mJ/cm2), con un valor de IC50 de 0.20 ± 0.03 µM [2].Con el objetivo de caracterizar los mecanismos involucrados en la fototoxicidad de Pc13, en primer lugar evaluamos la vía de internalización de esta ftalocianina. La incubación de las células B16F0 a 4°C disminuyó significativamente la captación de Pc13, sugiriendo la participación de un mecanismo endocítico. Cuando las células fueron preincubadas con inhibidores específicos de dinamina (Dynasore) o de la endocitosis mediada por caveolina (Nistatina), se produjo una menor muerte celular luego de la PDT, lo cual fue determinado mediante el método de la Hexosaminidasa. Resultados similares fueron obtenidos cuando se transfectaron las células con mutantes dominantes negativas de dinamina y caveolina. Por el contrario, el bloqueo de la endocitosis mediada por clatrina no afectó la fototoxicidad de Pc13.Puesto que los melanosomas son organelas de origen endosomal específicas de los melanocitos, a continuación examinamos la presencia de Pc13 en estas vesículas. Mediante microscopía confocal demostramos que Pc13 efectivamente se localiza en los melanosomas y que se produce un marcado daño en estas estructuras luego de la irradiación, lo cual fue confirmado mediante microscopía electrónica de transmisión. Posteriormente, para estudiar el rol de los melanosomas y su contenido en la acción fototóxica de Pc13, utilizamos un inhibidor químico de la melanogénesis llamado feniltiourea (PTU). Mientras que la preincubación de las células B16F0 durante 48 h con PTU produjo su depigmentación y potenció la fototoxicidad de Pc13, un período de inhibición más corto de 3 h no generó alteraciones en los niveles de melanina pero disminuyó significativamente la muerte celular luego de la PDT.En conclusión, demostramos que Pc13 es internalizada en las células de melanoma a través de un mecanismo endocítico dependiente de dinamina y caveolina, siendo los melanosomas uno de sus sitios primarios de localización subcelular. El daño en estas organelas luego de la irradiación produce la liberación de melanina e intermediarios de síntesis, que tienen roles opuestos en la muerte celular desencadenada por el tratamiento. Mientras que la melanina disminuye la acción fototóxica de Pc13 debido a sus propiedades antioxidantes, la liberación de intermediarios citotóxicos favorece la muerte de las células de melanoma.