Clonado y caracterización funcional de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) de Leishmania major.

SOSA MÁXIMO,; NOWICKI CRISTINA

Santa Fe, prov Santa Fe

Congreso; XXIII Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología,; 2009

Clonado y caracterización funcional de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) de Leishmania major. Máximo Sosa y Cristina Nowicki.   Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA-CONICET) Buenos Aires, Argentina. cnowicki@criba.edu.ar  Hay evidencias experimentales que muestran que Leishmania puede sintetizar de-novo glucosa. Este proceso gluconeogénico no es idéntico al de los mamíferos. Por ejemplo, estos parásitos carecerían de piruvato carboxilasa, enzima mitocondrial que en los tejidos gluconeogénicos produce el oxalacetato que se deriva a la síntesis de novo de glucosa. Sin embargo, se observó que amastigotes y promastigotes de L. mexicana cultivados en medios pobres de glucosa pueden utilizar tanto aspartato como alanina para sintetizar de novo carbohidratos. Este proceso tendría relevancia fisiológica ya que la inactivación de la fructosa 1, 6 bisfosfatasa disminuye la virulencia de amastigotes de Leishmania. En coherencia con la posible relevancia biológica del proceso gluconeogénico en estos parásitos, la actividad de PEPCK es aproximadamente 10 veces más alta en los extractos crudos de amastigotes que en los obtenidos a partir promastigotes. Las aminotrasnferasas o la malato deshidrogenasa presentes en el citosol de amastigotes podrían producir el oxalacetato necesario para que la PEPCK pueda formar fosfoenolpiruvato y este se utilice como precursor en la síntesis de glucosa. Con el propósito de conocer las propiedades bioquímicas de la putativa PEPCK de Leishmania decidimos clonar y caracterizar esta enzima. El putativo gen de la PEPCK de L. major se amplificó por PCR en base a secuencia nucleotídicas identificadas en las bases de datos. El fragmento de ADN se clonó en pET28 y se le agregó una secuencia codificante para 6xHis al extremo 5´. La enzima recombinante se expresó en cultivos de E. coli y se purificó por cromatografía de afinidad a metales. Se obtuvo un rendimiento de aprox. 3 mg por litro de cultivo y la PEPCK purificada presentó una actividad específica de aproximadamente 30 U.mg-1 tanto cuando se midió el consumo de fosfoenolpiruvato como el de oxalacetato. Estos valores son muy similares a los informados para su homologo de mamíferos. Se sabe que las PEPCKs de tripanosomátidos utilizan ADP, en cambio la PEPCK de mamíferos pertenece al grupo de las que utilizan GDP. Las diferencias estructurales entre ambos tipos de enzimas permitirían considerar a la PEPCK como un potencial blanco terapéutico en caso de que ésta resultara esencial para la sobrevida/infectividad de parásitos de Leishmania