Regulación de ATP extracelular de eritrocitos humanos expuestos a alfa hemolisina asociada a vesículas de membrana externa

LAURI, NATALIA; MATÉ, SABINA; ALVAREZ, CORA LILIA; L.Z.F. GROSS; SCHWARZBAUM PABLO JUIO; LEAL DENIS MARÍA FLORENCIA; S. VENERUS ARBILLA; HERLAX, VANESA

La Plata

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS); 2016

La α-hemolisina (HlyA) es una toxina extracelular secretada por cepas uropatogénicas de Escherichia coli. Estas cepas pueden secretar al lumen vascular HlyA libre o asociada a vesículas llamadas OMVs (outer membrane vesicles). Ambas formas pueden interactuar con la membrana plasmática de eritrocitos humanos (h-RBCs), induciendo cambios metabólicos poco conocidos.Estudiamos si HlyA asociada a OMVs (OMVs-HlyA) es capaz de activar la salida de ATP de h-RBCs, provocando cambios temporales en la acumulación de ATP extracelular (cinética de ATPe). Se aislaron OMVs-HlyA a partir una cepa de E. coli WAM1824. Los h-RBCs (2 108 células) fueron expuestos a concentraciones variables de OMVs-HlyA por 5 y 10 min a 37°C. Cambios en la [ATPe] fueron determinados por una reacción luminiscente (luciferina-luciferasa). Los resultados muestran que OMV-HlyA indujo salida de ATP y hemólisis de distinta magnitud, dependiendo de la concentración de OMVs y del tiempo de exposición. Con 5 ng prot/μl de OMV-HlyA, la [ATPe] se incrementó de 383 ± 54 (5 min) a 1117 ± 533 nM (10 min), mientras que el % de hemólisis fue de 0.1% y 0.8%, respectivamente; indicando que éste incremento correspondió mayormente a salida no lítica de ATP.Con 10 ng prot/μl de OMV-HlyA, la hemólisis se incrementó de 9.4% (5 min) a 42.2% (10 min), lo que llevaría a un incremento de la [ATPe] por salida lítica de ATP. Sin embargo, la [ATPe] disminuyó de 40 ± 7 µM (5 min) a 4 ± 2 µM (10 min). Este resultado podría deberse a un incremento en la hidrólisis de ATPe por ATPasas intracelulares liberadas por hemólisis. En efecto, al determinar la velocidad de hidrólisis de ATPe de hemolisados de h-RBCs, observamos que la actividad ATPasica fue una función lineal del número de células lisadas, con actividad ATPasica a 600nM ATP de 6 nM/(min 106células lisadas). Es decir, que el aumento observado en el grado de hemólisis (5 min vs 10 min de exposición) permitiría explicar la disminución de la [ATPe] con el tiempo de incubación, considerando que la actividad ATPasica de las OMVs es despreciable en estas condiciones.En resumen OMVs-HlyA induce salida de ATP, tanto lítica como no lítica. A mayor concentración de OMVs-HlyA se esperaba observar una mayor [ATPe], pero por el contrario ésta disminuye debido a la actividad de ATPasas intracelulares liberadas al medio por hemólisis. Con subsidios UBACYT (20020130100027BA), PICT 2014-0327, CONICET (PIP 20110100639 Y 11220150100459) y ECOS Sud (Francia)-MINCYT(Argentina) A15S01, PDTS-CIN 193.